[發(fā)明專利]用于生產(chǎn)葫蘆二烯醇的工程菌及其制備方法與應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710659583.2
• 申請(qǐng)日: 2017-08-04
• 公開（公告）號(hào): CN109385377A
• 公開（公告）日: 2019-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張學(xué)禮;宋云飛;孫媛霞;戴住波;李元元;戴隆海;王冬;劉怡;林庭庭;唐金磊;李守連;李宇鈺
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所;桂林萊茵生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N15/81;C12P33/00;C12R1/865
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;張立娜

本發(fā)明公開了一種用于生產(chǎn)葫蘆二烯醇的工程菌及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明提供了制備用于生產(chǎn)葫蘆二烯醇的工程菌的方法，包括如下步驟：向能夠產(chǎn)生2,3?環(huán)氧鯊烯的受體菌株中導(dǎo)入葫蘆二烯醇合成酶的編碼基因，得到重組菌；從所述重組菌中獲得所述用于生產(chǎn)葫蘆二烯醇的工程菌；所述葫蘆二烯醇合成酶的氨基酸序列為序列表中序列5或序列6或序列7。本發(fā)明成功運(yùn)用生物工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)了葫蘆二烯醇生物合成途徑的異源重建及產(chǎn)物的生產(chǎn)，搖瓶發(fā)酵法葫蘆二烯醇產(chǎn)量高達(dá)82.89mg·L^?1；同時(shí)并通過(guò)重組菌株的高密度發(fā)酵技術(shù)，再提高葫蘆二烯醇產(chǎn)量20.48倍。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于生產(chǎn)葫蘆二烯醇的工程菌及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

葫蘆二烯醇(Cucurbitadienol)是從羅漢果、栝樓、西瓜、冬瓜和苦瓜等多種葫蘆科植物中分離獲得的葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物的基本前體，其在生物體內(nèi)能被進(jìn)一步被酶修飾形成羅漢果甜苷和葫蘆素等化合物。其中羅漢果甜苷Ⅴ是羅漢果果實(shí)甜味的主要成分，甜度是蔗糖的250倍，是糖尿病患者和肥胖者食品的良好添加劑；另外，葫蘆素等苦味成分具有廣泛的生物活性，如護(hù)肝，抗炎，抗菌，驅(qū)蟲以及對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管具有保護(hù)作用；一些葫蘆素還可以作為蛻皮類固醇受體激動(dòng)劑和拮抗劑。

運(yùn)用合成生物學(xué)策略實(shí)現(xiàn)中藥有效成分生物合成途徑的異源重建及產(chǎn)物的生產(chǎn)，能夠積極促進(jìn)生物合成途徑解析和利用，如丹參酮，嗎啡和人參皂苷等成分的生物合成途徑的研究。在生產(chǎn)方面，Keasling團(tuán)隊(duì)耗時(shí)10年，將黃花蒿中青蒿酸的合成途徑完全解析，并在釀酒酵母中完成了抗瘧藥物前體—青蒿酸的異源合成工作，青蒿酸的產(chǎn)量達(dá)25g·L^-1。

在生物體內(nèi)2,3-環(huán)氧鯊烯能被不同三萜環(huán)合酶環(huán)合為齊墩果烷型，烏蘇烷型，羽扇豆烷型，達(dá)瑪烷型和葫蘆烷型等多種類型三萜母核。其中葫蘆二烯醇合成酶(Cucurbitadienol synthase,CBS)能催化2,3-環(huán)氧鯊烯生成葫蘆二烯醇。目前來(lái)源于羅漢果、南瓜、黃瓜和藥西瓜等葫蘆二烯醇合酶已經(jīng)被成功克隆。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于生產(chǎn)葫蘆二烯醇的工程菌及其制備方法與應(yīng)用。

本發(fā)明所提供的制備用于生產(chǎn)葫蘆二烯醇的工程菌的方法，包括如下步驟：使能夠產(chǎn)生2,3-環(huán)氧鯊烯的受體菌株表達(dá)葫蘆二烯醇合成酶，從而獲得所述用于生產(chǎn)葫蘆二烯醇的工程菌；所述葫蘆二烯醇合成酶的氨基酸序列為序列表中序列5或序列6或序列7。

進(jìn)一步，所述方法包括如下步驟：向能夠產(chǎn)生2,3-環(huán)氧鯊烯的受體菌株中導(dǎo)入所述葫蘆二烯醇合成酶的編碼基因，得到表達(dá)所述葫蘆二烯醇合成酶的編碼基因的重組菌，即為所述用于生產(chǎn)葫蘆二烯醇的工程菌。

更進(jìn)一步，所述葫蘆二烯醇合成酶的編碼基因具體可為如下任一所示DNA分子：

(1)序列表中序列1所示的DNA分子；

(2)序列表中序列2所示的DNA分子；

(3)序列表中序列3所示的DNA分子；

(4)序列表中序列4所示的DNA分子；

(5)在嚴(yán)格條件下與(1)-(4)中任一限定的DNA分子雜交且編碼序列表中序列5或序列6或序列7所示葫蘆二烯醇合成酶的DNA分子；

(6)與(1)-(5)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且編碼序列表中序列5或序列6或序列7所示葫蘆二烯醇合成酶的DNA分子。

上述嚴(yán)格條件可為用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下雜交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。