[發(fā)明專(zhuān)利]三重轉(zhuǎn)錄因子及其在哺乳動(dòng)物蛋白表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710658328.6
• 申請(qǐng)日: 2017-08-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109384838B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-07-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何南海;路楊;楊東暉;王驥
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 杭州阿諾生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/47
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/47;C07K1/14;C12N15/12;C12N15/85
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 王學(xué)強(qiáng)

1.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，為含有編碼核酸的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體；所述編碼核酸的堿基序列由編碼ELL2轉(zhuǎn)錄因子的堿基序列、編碼AFF4轉(zhuǎn)錄因子的堿基序列和編碼CRTC2轉(zhuǎn)錄因子的堿基序列組成；

所述哺乳動(dòng)物表達(dá)載體為含有CMV啟動(dòng)子的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。

2.一種權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體的制備方法，其特征在于，其包含下述步驟：

(1)將編碼ELL轉(zhuǎn)錄因子、AFF轉(zhuǎn)錄因子和CRTC轉(zhuǎn)錄因子的基因分別與載體連接，得到含有三重轉(zhuǎn)錄因子的重組載體；

(2)將步驟(1)所得到的重組載體轉(zhuǎn)化到受體細(xì)胞，篩選得到轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的載體；

(3)將步驟(2)所得到的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的載體進(jìn)行DNA測(cè)序，得到重組表達(dá)載體。

3.一種哺乳動(dòng)物蛋白表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于，

其通過(guò)將權(quán)利要求1所述的重組表達(dá)載體和LIF表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染到細(xì)胞株中表達(dá)得到，

或通過(guò)將權(quán)利要求2制備得到的重組表達(dá)載體和LIF表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染到細(xì)胞株中表達(dá)得到，

所述重組表達(dá)載體的總量與LIF表達(dá)載體的總量的比為1：1-5。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的哺乳動(dòng)物蛋白表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于，所述細(xì)胞株選自于人胚胎腎細(xì)胞293或者中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中的一種。

5.一種權(quán)利要求3或4所述的哺乳動(dòng)物蛋白表達(dá)系統(tǒng)的制備方法，其包含下述步驟：

(1)將重組表達(dá)載體和LIF表達(dá)載體總量比為1：1-5共同轉(zhuǎn)染到細(xì)胞株中；

(2)1-3天后收集細(xì)胞，得到哺乳動(dòng)物蛋白表達(dá)系統(tǒng)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，在步驟(1)中，所述LIF載體的制備方法包含下述步驟：將LIF及表達(dá)載體連接得到LIF表達(dá)載體。

7.一種哺乳動(dòng)物蛋白的純化方法，其包含下述步驟：

(1)收集權(quán)利要求3或4所述的哺乳動(dòng)物蛋白表達(dá)系統(tǒng)細(xì)胞，加入裂解液，離心得到上清液；

(2)將步驟(1)所述的上清液與標(biāo)簽beads混合，離心去除上清液，然后加入高鹽洗滌液洗滌；

(3)將步驟(2)所得的洗滌液離心，去除上清液，加入低鹽洗滌液洗滌；

(4)用帶有標(biāo)記peptide進(jìn)行洗脫，然后離心得到上清液，所述上清液即為哺乳動(dòng)物蛋白。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的純化方法，其特征在于，在步驟(1)中，所述裂解液包含4-羥乙基哌嗪乙磺酸、甘油、NaCl、EDTA、乙基苯基聚乙二醇和蛋白酶抑制劑混合物，所述裂解液的加入量為每1×10 ⁷ 個(gè)細(xì)胞加入1-5ml的裂解液。

9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的純化方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述上清液與標(biāo)簽beads的體積比為20-50:1。

10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)所述的純化方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述高鹽洗滌液包含4-羥乙基哌嗪乙磺酸、甘油、NaCl、EDTA、乙基苯基聚乙二醇和蛋白酶抑制劑混合物，所述高鹽洗滌液的加入量為1-5ml。

11.根據(jù)權(quán)利要求7-10任一項(xiàng)所述的純化方法，其特征在于，在步驟(3)中，所述低鹽洗滌液包含4-羥乙基哌嗪乙磺酸、甘油、NaCl、EDTA、乙基苯基聚乙二醇和蛋白酶抑制劑混合物，所述低鹽洗滌液的加入量為1-5ml。

12.根據(jù)權(quán)利要求7-10任一項(xiàng)所述的純化方法，其特征在于，所述標(biāo)簽peptide與標(biāo)簽beads的體積比為3-5：1。

13.權(quán)利要求3或4所述的哺乳動(dòng)物蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白，或權(quán)利要求5或6所述制備方法制得的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白，或7~12任一項(xiàng)所述方法純化得到的哺乳動(dòng)物蛋白在制備促進(jìn)干細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制干細(xì)胞分化的藥物中的應(yīng)用。