[發(fā)明專利]一種諾麗內(nèi)生真菌的分離鑒定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710657484.0
• 申請(qǐng)日: 2017-08-03
• 公開（公告）號(hào): CN107236820B
• 公開（公告）日: 2020-04-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳友根;馬文婷;胡征波
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 海南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/04;C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 劉奇

本發(fā)明涉及一種諾麗內(nèi)生真菌的分離鑒定方法，屬于微生物分離鑒定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的諾麗內(nèi)生真菌的分離鑒定方法包括以下步驟：1)對(duì)諾麗果和葉進(jìn)行表面消毒；2)將諾麗果和葉的內(nèi)部組織置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上25±1℃黑暗條件下培養(yǎng)8～10天；3)將步驟2)培養(yǎng)得到的菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，通過4～5次連續(xù)的菌絲尖端轉(zhuǎn)移進(jìn)行純化，得到諾麗內(nèi)生真菌；4)對(duì)步驟3)得到的諾麗內(nèi)生真菌進(jìn)行ITS測(cè)序鑒定。本發(fā)明提供的方法能夠?qū)崿F(xiàn)諾麗內(nèi)生真菌的有效分離和鑒定，利用分離得到的內(nèi)生真菌通過發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)相應(yīng)的活性物質(zhì)，為發(fā)掘內(nèi)生真菌在諾麗中的藥效作用奠定基礎(chǔ)，亦為抗癌、抗炎藥物的研發(fā)提供新思路。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物分離鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種諾麗內(nèi)生真菌的分離鑒定方法。

背景技術(shù)

植物內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)是指那些生活在地上部分且活的植物組織體內(nèi)，但不引起宿主植物患病的一類有益真菌。因此，植物內(nèi)生真菌是植物體內(nèi)微生態(tài)系統(tǒng)中的天然組成成分，其長(zhǎng)期生活在植物體內(nèi)這種特殊環(huán)境中，不會(huì)導(dǎo)致植物患病，反而與宿主植物協(xié)同進(jìn)化，并在演化過程中逐漸形成互惠共生的關(guān)系。藥用植物內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物十分豐富，具有抗菌、抗腫瘤、抗病毒、殺蟲、調(diào)節(jié)免疫及促進(jìn)植物生長(zhǎng)等生物活性，是篩選生物活性成分或先導(dǎo)化合物的有效途徑之一，在工業(yè)發(fā)酵、生物制藥、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

諾麗(Morinda citrifolia Linn.)是茜草科巴戟天屬的植物，在熱帶地區(qū)有著悠久的食用歷史，最早可追溯到317世紀(jì)晚期。1943年，美國(guó)政府將諾麗果認(rèn)定為可食用植物資源；2003年，歐盟委員會(huì)提名諾麗果汁為一種新資源食品；2010年5月，中國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)諾麗果漿為新資源食品。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究證明，諾麗果和果汁對(duì)某些疾病具有一定的治療和輔助治療作用，如抗腫瘤、提高免疫力、抗氧化、護(hù)肝、抗菌消炎、改善糖尿病、抗血脂、降血壓、改善痛風(fēng)等。近幾年來，隨著研究的不斷深入和新功能的不斷發(fā)現(xiàn)，諾麗果已經(jīng)成為世界藥用植物和保健飲料的新寵。

諾麗因其卓有特效的抗癌效果而屢遭砍伐及毀滅性利用，加上種群分布的局限性，使得該植物種質(zhì)資源并不豐富，甚至于處于瀕危滅絕的邊緣。由于內(nèi)生真菌具有產(chǎn)生和寄主植物一樣的次生代謝產(chǎn)物和活性成分，且分離純化的內(nèi)生真菌能通過發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)相應(yīng)的活性物質(zhì)，內(nèi)生真菌的藥用價(jià)值已成為國(guó)際熱點(diǎn)，需最大可能地保留內(nèi)生真菌不被殺滅。目前內(nèi)生真菌常采用組織分離法分離，其缺陷有：(1)表面過分消毒，殺死部分內(nèi)生真菌；(2)表面消毒不充分，表面菌污染；(3)生長(zhǎng)快的內(nèi)生真菌覆蓋一些生長(zhǎng)緩慢的真菌；(4)所用培養(yǎng)基不能確保所有內(nèi)生真菌都生長(zhǎng)。諾麗內(nèi)生真菌的藥用潛力并沒有實(shí)現(xiàn)較大程度的挖掘。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種諾麗內(nèi)生真菌的分離鑒定方法。本發(fā)明提供的方法能夠?qū)崿F(xiàn)諾麗內(nèi)生真菌的有效分離和鑒定，為抗癌、抗炎藥物研發(fā)提供新思路。

本發(fā)明提供了一種諾麗內(nèi)生真菌的分離鑒定方法，包括以下步驟：

1)對(duì)諾麗果和葉進(jìn)行表面消毒；

2)將諾麗果和葉的內(nèi)部組織置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，25±1℃黑暗條件下培養(yǎng)8～10天；

3)將步驟2)培養(yǎng)得到的菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，通過4～5次連續(xù)的菌絲尖端轉(zhuǎn)移進(jìn)行純化，得到諾麗內(nèi)生真菌；

4)對(duì)步驟3)得到的諾麗內(nèi)生真菌進(jìn)行ITS測(cè)序鑒定。

優(yōu)選的是，所述步驟1)中的諾麗果和葉為八成熟。

優(yōu)選的是，所述步驟1)的表面消毒包括次氯酸鈉溶液消毒和乙醇溶液消毒。

優(yōu)選的是，所述次氯酸鈉溶液中次氯酸鈉的質(zhì)量濃度為2.6～3.5％，所述乙醇溶液中乙醇的質(zhì)量濃度為75％。

優(yōu)選的是，次氯酸鈉溶液消毒的時(shí)間為60～300s，乙醇溶液消毒的時(shí)間為30～180s。