[發明專利]利用SMRT測序技術進行液體酵素菌種鑒定的方法在審

申請號：	201710654430.9	申請日：	2017-08-03
公開（公告）號：	CN107287332A	公開（公告）日：	2017-10-24
發明（設計）人：	萬君興;華子昂;白玉杰;王翠芳;陳長風	申請（專利權）人：	華子昂
主分類號：	C12Q1/68	分類號：	C12Q1/68;C12Q1/06;G06F19/22
代理公司：	銀川長征知識產權代理事務所64102	代理人：	陳曉慶
地址：	116000 遼寧省大連市大***	國省代碼：	遼寧;21
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摘要：
搜索關鍵詞：	利用 smrt 技術進行液體酵素菌種鑒定方法
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【說明書】：

技術領域：

本發明屬于基因檢測技術領域，具體涉及一種利用SMRT測序技術進行液體酵素菌種鑒定的方法。

背景技術：

液體酵素是一種利用植物等生物材料在一定的發酵工藝條件下，以特定微生物為菌種發酵而成的一種生物制品，其中包含酶、有機酸、微量元素、氨基酸、維生素多種成分。酵素在人類的美容，健康等領域已經得到了廣泛的應用。液體酵素的制作過程中，微生物的種類和數量變化對最終的酵素成品中的成分有著重要的影響，而且作為食用的酵素要嚴格控制有害微生物的摻入，因此，對酵素中的微生物進行種類和豐度的鑒定，對酵素的品質改進、發酵工藝改進和安全性評價有著極為重要的影響。

微生物的鑒定方法多種多樣，傳統的微生物分類和鑒定方法主要以微生物的形態結構和培養特性觀察、生理生化實驗結果作為鑒定依據，鑒定過程較為繁瑣、復雜，需花費大量的人力勞動。隨著基因檢測技術的快速發展，利用基因檢測技術來進行微生物鑒定已經成為該領域的金標準?；驒z測進行微生物物種鑒定方法有一代測序，二代測序、定量PCR等等，其中定量PCR多用于特定病原的鑒定；一代測序主要用于微生物種類本身多樣性水平不高的樣本；二代測序在微生物菌種鑒定方面取得了巨大的進步，但是二代測序由于其本身的技術局限性，測序范圍僅僅針對局部高變區進行測序，測序范圍一般300bp以內，這種局限性對結果的精確性產生了不小的影響，而且對于二代測序對高GC 含量、重復序列多的DNA模板難以進行正常的測序反應，不僅在測序結果的拷貝數以及堿基讀取準確性上都比較差。

單分子測序技術(SMRT測序技術)，即第三代測序技術現已獲得廣泛應用。 SMRT測序技術是在DNA測序時不需要經過PCR擴增，實現對每一條DNA分子的單獨測序，具有讀長長、速度快、精度高等特點，主要被應用于基因組測序、DNA甲基化研究、SNP檢測等方面。目前，基于SMRT測序技術的PacBio RSⅡ測序儀平均讀長超過14Kb，且沒有GC偏好，可以輕松應對重復序列。 16SrRNA基因是原核生物所特有的核酸序列，該片段被用于細菌的鑒定已經有大量應用。鑒于此，針對液體酵素在菌種鑒定方面的需要，有必要提供一種相對于二代測序可以應對復雜樣本，鑒定的結果具有更高的可靠性的液體酵素菌種鑒定的新方法。

發明內容：

本發明的目的旨在針對現有技術存在的不足，提供一種以16sRNA基因為標記基因，基于SMRT測序技術對16sRNA基因進行分型，實現對液體酵素中微生物在種水平的鑒定和豐度分析的方法。

為實現上述目的，本發明采取以下技術方案：

利用SMRT測序技術進行液體酵素菌種鑒定的方法，具體包括以下步驟：

1)采集液體酵素DNA樣本，針對細菌16sRNA進行引物設計，然后進行 PCR擴增，得到PCR產物；

2)將得到的PCR產物構建2K文庫，然后在PacBio RS II測序儀上進行測序，得到原始序列；

3)對測序得到的原始序列采用SMRT ananlysisV2.3軟件進行校正，然后導出序列，以備生物信息學分析；

4)利用MothurV1.35.1軟件對原始序列進行去嵌合體、去除碎片DNA等操作，然后進行菌種鑒定和豐度分析。

本發明的方法適用于對液體酵素中菌種進行鑒定分析，通過基于SMRT測序技術對16sRNA基因進行分型，實現了對液體酵素中微生物在種水平的鑒定和豐度分析，與現有技術相比，該方法不僅能應對相對復雜的樣本，并且鑒定的結果可靠性更高。

附圖說明：

圖1是本發明實施例1中測序結果的原始狀況圖；

圖2是本發明實施例1中酵素優勢菌種種水平分類學鑒定結果圖。