[發明專利]一種hAECs?DED組織工程皮膚增殖分化活力的檢測方法

在審

• 申請號: 201710654060.9
• 申請日: 2017-08-03
• 公開（公告）號: CN107389417A
• 公開（公告）日: 2017-11-24
• 發明（設計）人: 江蕾微;陸洪光;聶瑛潔;盛良;徐艷艷;齊珺
• 申請（專利權）人: 貴州省人民醫院
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30;G01N33/48
• 代理公司: 常州市華信天成專利代理事務所(普通合伙)32294
• 代理人: 何學成

1.一種hAECs-DED組織工程皮膚增殖分化活力的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)構建hAECs-DED組織工程皮膚結構：以人羊膜上皮細胞(hAECs)作為種子細胞，以人去表皮的真皮組織(De-epidermized dermis,DED)作為支架材料，將種子細胞種植于支架材料上構建hAECs-DED組織工程皮膚；

2)組織工程皮膚組織學觀察：將體外培養的hAECs-DED組織工程皮膚氣-液面培養2周后進行肉眼觀察，主要觀察表面是否光滑，是否有膜狀物形成；再進行常規石蠟切片(約4um)，蘇木精-伊紅染色(HE染色)，在光鏡下觀察組織學特征，觀察新生表皮結構是否清晰，層次是否分明，角質層角化是否完全，細胞排列是否整齊；

3)免疫組化染色：包括廣譜細胞角蛋白免疫組化染色(CKpan染色)、波形蛋白免疫組化染色(vimentin染色)、Ki67免疫組化染色、角蛋白19(CK19)免疫組化染色、角蛋白18(CK18)免疫組化染色、角蛋白14(CK14)免疫組化染色、角蛋白10(CK10)免疫組化染色、絲聚合蛋白(Filaggrin)免疫組化染色、過碘酸雪夫氏染色(PAS)、Ⅳ型膠原染色、層粘蛋白染色(laminin染色)、橋粒芯蛋白免疫組化染色(desmoglein)；

4)透射電鏡觀察組織工程皮膚超微結構，并拍片；主要觀察細胞質內線粒體(mitochondria，Mt)和角蛋白細絲(keratin filaments,KF)結構、以及相鄰的細胞膜上的細胞橋粒(desmosomes，D)結構、新生表皮與DED之間是否可見基底膜結構，以及基底膜帶的近表皮側是否可見半橋粒(Hemidesmosomes，HD)結構。

2.根據權利要求1所述的一種hAECs-DED組織工程皮膚增殖分化活力的檢測方法，其特征在于，步驟2)所述蘇木精-伊紅染色(HE染色)的具體操作方法為：二甲苯4min，二甲苯4min，二甲苯4min,100％乙醇4min,100％乙醇4min,95％乙醇4min,95％乙醇4min,95％乙醇4min,70％乙醇4min,蒸餾水,蘇木素染色4min,水洗5min,伊紅染色3Osec,70％乙醇15sec,70％乙醇15sec,95％乙醇15sec,95％乙醇15sec,100％乙醇3Osec,100％乙醇3Osec,二甲苯5min,二甲苯5min,固定，封片。