[發(fā)明專(zhuān)利]自體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法和使用的培養(yǎng)基

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710653584.6
• 申請(qǐng)日: 2017-08-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107384857B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-07-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李詣書(shū);周丹;王正
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣州中科博雅干細(xì)胞科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/0775
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/0775
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

1.脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其包括如下步驟：

(1)培養(yǎng)預(yù)處理：將采集的脂肪轉(zhuǎn)移至生物安全柜，倒入裝有含青鏈霉素的PBS的培養(yǎng)皿中，使用無(wú)菌手術(shù)剪和無(wú)菌鑷子取出脂肪上的血管和結(jié)締組織，使用PBS清洗脂肪組織；

(2)貼壁培養(yǎng)：將脂肪組織剪成4-5mm³大小的碎塊，取干凈的10cm培養(yǎng)皿，用鑷子將脂肪碎塊貼于培養(yǎng)皿內(nèi)，一個(gè)培養(yǎng)皿貼10-15塊，在生物安全柜中晾干30min左右，每個(gè)培養(yǎng)皿添加10ml完全培養(yǎng)基；

(3)補(bǔ)液與換液：每隔3天進(jìn)行補(bǔ)液，添加5ml完全培養(yǎng)基/皿，當(dāng)有細(xì)胞爬出后，進(jìn)行全換液，10ml完全培養(yǎng)基/皿；當(dāng)有成片細(xì)胞爬出后，將脂肪組織塊去掉，并進(jìn)行全換液；

(4)細(xì)胞傳代：

(4a)清洗：將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基吸出并棄去，吸取PBS加入每個(gè)培養(yǎng)皿中，5ml/皿，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使PBS能充分清洗細(xì)胞表面，吸出PBS并棄去；

(4b)消化：加入0.25%胰酶，使胰酶覆蓋細(xì)胞表面，室溫消化2-5分鐘，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)所有細(xì)胞均變圓并脫離培養(yǎng)皿時(shí)，輕拍培養(yǎng)皿，使所有細(xì)胞脫落并懸浮于培養(yǎng)皿中，顯微鏡下觀察確保所有細(xì)胞均脫落后，將培養(yǎng)皿移至生物安全柜中；

(4c)中止：每皿加入2~5mL與胰酶等體積的完全培養(yǎng)基，混勻，中止胰酶消化；

(4d)收集：用移液管吸取培養(yǎng)皿中的細(xì)胞懸液，并收集至50ml離心管中，再用PBS沖洗培養(yǎng)皿，確保所有細(xì)胞均被收集；

(4e)離心：將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，配平，調(diào)整轉(zhuǎn)速1500rpm，時(shí)間5分鐘，升速9，降速7，開(kāi)始離心；

(4f)重懸：離心結(jié)束后，取出離心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并棄去，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，將多管細(xì)胞懸液合并為一管，混勻后取樣計(jì)數(shù)及檢測(cè)細(xì)胞存活率；

(4g)傳代：按5000-8000個(gè)細(xì)胞/cm²的密度將細(xì)胞接種至T75培養(yǎng)瓶中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4天，得到P1代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；

(4h)任選的，依照以上步驟(4a)至步驟(4g)的操作進(jìn)行細(xì)胞傳代，依次得到P2代至P5代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；

(4i)任選的，使得到的P1代至P5代的任一代或多代的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行制劑的制備；

(4j)任選的，使得到的P1代至P5代的任一代或多代的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞凍存，任選的對(duì)所凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，以及任選的對(duì)復(fù)蘇的細(xì)胞進(jìn)行制劑的制備，

其中，所述完全培養(yǎng)基組成為：100mL的FBS、丙二醇2g、果糖500mg、無(wú)水氯化鈣265mg、硝酸鐵0.1mg、氯化鉀400mg、無(wú)水硫酸鎂97.67mg、氯化鈉6400mg、無(wú)水磷酸二氫鈉109mg、丁二酸75mg、丁二酸鈉100mg、L-鹽酸精氨酸84mg、L-鹽酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-鹽酸組氨酸42mg、L-異亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-鹽酸賴(lài)氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-絲氨酸42mg、L-蘇氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-纈氨酸94mg、D-泛酸鈣4mg、酒石酸膽堿7.2mg、葉酸4mg、肌醇7.2mg、煙酰胺4mg、核黃素0.4mg、鹽酸硫胺4mg、鹽酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸鈉110mg、酚紅9.3mg、水適量加至1000mL。

2.根據(jù)權(quán)利要求1的培養(yǎng)方法，其中，當(dāng)在細(xì)胞傳代的過(guò)程中，在步驟(4g)的操作中，在融合率達(dá)到80-90%時(shí)，進(jìn)行下一代的細(xì)胞傳代或者進(jìn)行制劑制備和/或細(xì)胞凍存。

3.根據(jù)權(quán)利要求1的培養(yǎng)方法，其中，所述脂肪是從眼袋和/或眼皮部位采集的眼部脂肪。

4.根據(jù)權(quán)利要求1的培養(yǎng)方法，其中，所述細(xì)胞凍存使用的凍存液組成為：1份DMSO：2份人血清白蛋白：7份完全培養(yǎng)基。

5.根據(jù)權(quán)利要求1的培養(yǎng)方法，其包括如下步驟：

(1)培養(yǎng)預(yù)處理：將采集的脂肪轉(zhuǎn)移至生物安全柜，倒入裝有含青鏈霉素的PBS的培養(yǎng)皿中，使用無(wú)菌手術(shù)剪和無(wú)菌鑷子取出脂肪上的血管和結(jié)締組織，使用PBS清洗脂肪組織；

(2)貼壁培養(yǎng)：將脂肪組織剪成4-5mm³大小的碎塊，取干凈的10cm培養(yǎng)皿，用鑷子將脂肪碎塊貼于培養(yǎng)皿內(nèi)，一個(gè)培養(yǎng)皿貼10-15塊，在生物安全柜中晾干30min左右，每個(gè)培養(yǎng)皿添加10ml完全培養(yǎng)基；

(3)補(bǔ)液與換液：每隔3天進(jìn)行補(bǔ)液，添加5ml完全培養(yǎng)基/皿，當(dāng)有細(xì)胞爬出后，進(jìn)行全換液，10ml完全培養(yǎng)基/皿；當(dāng)有成片細(xì)胞爬出后，將脂肪組織塊去掉，并進(jìn)行全換液；

(4) P0代-P1代的細(xì)胞傳代：

(4a)清洗：將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基吸出并棄去，吸取PBS加入每個(gè)培養(yǎng)皿中，5ml/皿，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使PBS能充分清洗細(xì)胞表面，吸出PBS并棄去；

(4b)消化：加入0.25%胰酶，使胰酶覆蓋細(xì)胞表面，室溫消化2-5分鐘，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)所有細(xì)胞均變圓并脫離培養(yǎng)皿時(shí)，輕拍培養(yǎng)皿，使所有細(xì)胞脫落并懸浮于培養(yǎng)皿中，顯微鏡下觀察確保所有細(xì)胞均脫落后，將培養(yǎng)皿移至生物安全柜中；

(4c)中止：每皿加入2~5mL與胰酶等體積的完全培養(yǎng)基，混勻，中止胰酶消化；

(4d)收集：用移液管吸取培養(yǎng)皿中的細(xì)胞懸液，并收集至50ml離心管中，再用PBS沖洗培養(yǎng)皿，確保所有細(xì)胞均被收集；

(4e)離心：將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，配平，調(diào)整轉(zhuǎn)速1500rpm，時(shí)間5分鐘，升速9，降速7，開(kāi)始離心；

(4f)重懸：離心結(jié)束后，取出離心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并棄去，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，將多管細(xì)胞懸液合并為一管，混勻后取樣計(jì)數(shù)及檢測(cè)細(xì)胞存活率；

(4g)傳代：按5000-8000個(gè)細(xì)胞/cm²的密度將細(xì)胞接種至T75培養(yǎng)瓶中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4天；

(5) P1-P2代的細(xì)胞傳代：

(5a)清洗：將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基吸出并棄去，吸取PBS加入每個(gè)培養(yǎng)瓶中，10ml/T75培養(yǎng)瓶，將培養(yǎng)瓶橫放并輕輕晃動(dòng)，使PBS能充分清洗細(xì)胞表面，吸出PBS并棄去；

(5b)消化：加入0.25%胰酶，3ml/T75瓶，蓋上瓶蓋，將培養(yǎng)瓶橫放，使胰酶覆蓋細(xì)胞表面，室溫消化2-5分鐘，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)所有細(xì)胞均變圓并脫離培養(yǎng)瓶時(shí)，輕拍培養(yǎng)瓶壁，使所有細(xì)胞脫落并懸浮于培養(yǎng)瓶中，顯微鏡下觀察確保所有細(xì)胞均脫落后，將培養(yǎng)瓶移至生物安全柜中；

(5c)中止：每瓶加入2~5mL與胰酶等體積的完全培養(yǎng)基，混勻，中止胰酶消化；

(5d)收集：用移液管吸取培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液，并收集至50ml離心管中，再用PBS沖洗培養(yǎng)瓶，確保所有細(xì)胞均被收集；

(5e)離心：將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，配平，調(diào)整轉(zhuǎn)速1500rpm，時(shí)間5分鐘，升速9，降速7，開(kāi)始離心；

(5f)重懸：離心結(jié)束后，取出離心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并棄去，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，將多管細(xì)胞懸液合并為一管，混勻后取樣計(jì)數(shù)及檢測(cè)細(xì)胞存活率；

(5g)傳代：按5000-8000個(gè)細(xì)胞/cm²的密度將細(xì)胞接種至T225培養(yǎng)瓶中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4天；

(6) P2-P3代的細(xì)胞傳代：

(6a)清洗：將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基吸出并棄去，吸取PBS加入每個(gè)培養(yǎng)瓶中，15ml/T225培養(yǎng)瓶，將培養(yǎng)瓶橫放并輕輕晃動(dòng)，使PBS能充分清洗細(xì)胞表面，吸出PBS并棄去；

(6b)消化：加入0.25%胰酶，5ml/T225瓶，蓋上瓶蓋，將培養(yǎng)瓶橫放，使胰酶覆蓋細(xì)胞表面，室溫消化2-5分鐘，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)所有細(xì)胞均變圓并脫離培養(yǎng)瓶時(shí)，輕拍培養(yǎng)瓶壁，使所有細(xì)胞脫落并懸浮于培養(yǎng)瓶中，顯微鏡下觀察確保所有細(xì)胞均脫落后，將培養(yǎng)瓶移至生物安全柜中；

(6c)中止：每瓶加入5mL與胰酶等體積的完全培養(yǎng)基，混勻，中止胰酶消化；

(6d)收集：用移液管吸取培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液，并收集至50ml離心管中，再用PBS沖洗培養(yǎng)瓶，確保所有細(xì)胞均被收集；

(6e)離心：將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，配平，調(diào)整轉(zhuǎn)速1500rpm，時(shí)間5分鐘，升速9，降速7，開(kāi)始離心；

(6f)重懸：離心結(jié)束后，取出離心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并棄去，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，將多管細(xì)胞懸液合并為一管，混勻后取樣計(jì)數(shù)及檢測(cè)細(xì)胞存活率；

(6g)傳代：按5000-8000個(gè)細(xì)胞/cm²的密度將細(xì)胞接種至T225培養(yǎng)瓶中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4天；

(7)細(xì)胞凍存：

(7a)清洗：將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基吸出并棄去，吸取PBS加入每個(gè)培養(yǎng)瓶中，15ml/T225培養(yǎng)瓶，將培養(yǎng)瓶橫放并輕輕晃動(dòng)，使PBS能充分清洗細(xì)胞表面，吸出PBS并棄去；

(7b)消化：加入0.25%胰酶，5ml/T225瓶，蓋上瓶蓋，將培養(yǎng)瓶橫放，使胰酶覆蓋細(xì)胞表面，室溫消化2-5分鐘，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)所有細(xì)胞均變圓并脫離培養(yǎng)瓶時(shí)，輕拍培養(yǎng)瓶壁，使所有細(xì)胞脫落并懸浮于培養(yǎng)瓶中，顯微鏡下觀察確保所有細(xì)胞均脫落后，將培養(yǎng)瓶移至生物安全柜中；

(7c)中止：每瓶加入5mL與胰酶等體積的完全培養(yǎng)基，混勻，中止胰酶消化；

(7d)收集：用移液管吸取培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液，并收集至50ml離心管中，再用PBS沖洗培養(yǎng)瓶，確保所有細(xì)胞均被收集；

(7e)離心：將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，配平，調(diào)整轉(zhuǎn)速1500rpm，時(shí)間5分鐘，升速9，降速7，開(kāi)始離心；

(7f)重懸：離心結(jié)束后，取出離心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并棄去，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，將多管細(xì)胞懸液合并為一管，混勻后取樣計(jì)數(shù)及檢測(cè)細(xì)胞存活率；

(7g)離心：將待凍存細(xì)胞懸液離心，調(diào)整轉(zhuǎn)速1500rpm，時(shí)間5分鐘，升速9，降速7，開(kāi)始離心；

(7hi)混合與分裝：細(xì)胞離心后移至生物安全柜，吸取并棄去上清液，加入凍存液重懸細(xì)胞沉淀，混合均勻以后，按照固定的體積將細(xì)胞懸液分裝至2ml凍存管中，放入凍存盒4度冰箱預(yù)冷30分鐘；

(7i)程序降溫：打開(kāi)程序降溫儀，設(shè)定好降溫程序，輸入細(xì)胞批號(hào)，連接液氮供給罐，啟動(dòng)程序，使程序降溫儀腔體溫度降至4度，將預(yù)冷好的凍存盒放入程序降溫儀，開(kāi)始降溫，整個(gè)降溫過(guò)程為90分鐘；

(7j)液氮儲(chǔ)存：取出完成降溫的凍存盒，放入凍存架中，放入MVE液氮儲(chǔ)存罐中，進(jìn)行凍存；

(8)復(fù)蘇凍存的P3代細(xì)胞

(8a)解凍：將凍存的細(xì)胞放入37度水浴鍋中，迅速晃動(dòng)，使細(xì)胞在1分鐘內(nèi)解凍迅速將解凍好的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至裝有完全培養(yǎng)基的離心管中；

(8b)離心：將裝有細(xì)胞懸液的離心管放入離心機(jī)，調(diào)整轉(zhuǎn)速1500rpm，時(shí)間5分鐘，升速9，降速7，開(kāi)始離心；

(8d)接種：將完全培養(yǎng)基移至培養(yǎng)瓶中，將離心后的細(xì)胞上清液吸出并棄去，使用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，加入培養(yǎng)瓶中，混勻后貼標(biāo)簽，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，融合率達(dá)到80-90%時(shí)，用于制備脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞制劑；

(9)制備脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞制劑：

待P4代細(xì)胞融合率達(dá)到80-90%時(shí)，按以下步驟收獲，制備用于面部填充或修飾的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞制劑：

(9a)清洗：將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基吸出并棄去，吸取PBS加入每個(gè)培養(yǎng)瓶中，15ml/T225培養(yǎng)瓶，將培養(yǎng)瓶橫放并輕輕晃動(dòng)，使PBS能充分清洗細(xì)胞表面，吸出PBS并棄去；

(9b)消化：加入0.25%胰酶，5ml/T225瓶，蓋上瓶蓋，將培養(yǎng)瓶橫放，使胰酶覆蓋細(xì)胞表面，室溫消化2-5分鐘，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)所有細(xì)胞均變圓并脫離培養(yǎng)瓶時(shí)，輕拍培養(yǎng)瓶壁，使所有細(xì)胞脫落并懸浮于培養(yǎng)瓶中，顯微鏡下觀察確保所有細(xì)胞均脫落后，將培養(yǎng)瓶移至生物安全柜中；

(9c)中止：每瓶加入5mL與胰酶等體積的完全培養(yǎng)基，混勻，中止胰酶消化；

(9d)收集：用移液管吸取培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞懸液，并收集至50ml離心管中，再用PBS沖洗培養(yǎng)瓶，確保所有細(xì)胞均被收集；

(9e)離心：將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，配平，調(diào)整轉(zhuǎn)速1500rpm，時(shí)間5分鐘，升速9，降速7，開(kāi)始離心；

(9f)重懸：離心結(jié)束后，取出離心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并棄去，用生理鹽水重懸細(xì)胞沉淀；

(9g)清洗：將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，配平，調(diào)整轉(zhuǎn)速1500rpm，時(shí)間5分鐘，升速9，降速7，開(kāi)始離心；離心結(jié)束后，取出離心管，放入生物安全柜中，吸出上清液并棄去，用生理鹽水重懸細(xì)胞沉淀；任選的重復(fù)該清洗步驟以進(jìn)行二次清洗；清洗后，用生理鹽水將多管細(xì)胞合并為一管，取樣計(jì)數(shù)及檢測(cè)細(xì)胞存活率；

(9h)離心：將細(xì)胞懸液放入臺(tái)式離心機(jī)中，配平，調(diào)整轉(zhuǎn)速1500rpm，時(shí)間5分鐘，升速9，降速7，開(kāi)始離心；

(9i)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞制劑：按照4×10⁶/ml的密度，用生理鹽水重懸，得到脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞制劑。

2 ．一種用于培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)基，其為完全培養(yǎng)基，其組成為：100mL的FBS、丙二醇2g、果糖500mg、無(wú)水氯化鈣265mg、硝酸鐵0.1mg、氯化鉀400mg、無(wú)水硫酸鎂97.67mg、氯化鈉6400mg、無(wú)水磷酸二氫鈉109mg、丁二酸75mg、丁二酸鈉100mg、L-鹽酸精氨酸84mg、L-鹽酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-鹽酸組氨酸42mg、L-異亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-鹽酸賴(lài)氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-絲氨酸42mg、L-蘇氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-纈氨酸94mg、D-泛酸鈣4mg、酒石酸膽堿7.2mg、葉酸4mg、肌醇7.2mg、煙酰胺4mg、核黃素0.4mg、鹽酸硫胺4mg、鹽酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸鈉110mg、酚紅9.3mg、水適量加至1000mL。