[發明專利]用于研究藥物吸收的心肌纖維化細胞模型的建立方法

在審

• 申請號: 201710653003.9
• 申請日: 2017-08-02
• 公開（公告）號: CN107312750A
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發明（設計）人: 高永林;李春梅;喬俊花
• 申請（專利權）人: 煙臺大學
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;G01N21/31;G01N27/04
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙)11369
• 代理人: 韓飛

1.用于研究藥物吸收的心肌纖維化細胞模型的建立方法，包括以下步驟：

(1)將大鼠心肌成纖維細胞采用高糖DMEM培養液于體積濃度為5％的CO₂培養箱中培養傳代；

(2)取步驟(1)中第四代后生長良好的大鼠心肌成纖維細胞于24孔板的Transwell小室的濾膜上構建心肌成纖維細胞模型；

(3)采用HBSS培養液洗滌步驟(2)得到的心肌成纖維細胞模型3-5次；

(4)測定步驟(3)所得的心肌成纖維細胞模型的跨膜電阻值；

(5)取步驟(4)中跨膜電阻值大于500Ω的心肌成纖維細胞模型，加入到含有PDGF的HBSS培養液中培養24-48h，獲得心肌纖維化細胞模型；

(6)另取步驟(4)中跨膜電阻值大于500Ω的心肌成纖維細胞模型加入到不含有PDGF的HBSS培養液中培養24-48h，獲得心肌纖維化細胞模型的空白對照樣；

(7)測定該心肌纖維化細胞模型和空白對照樣的吸光度值，以判斷心肌纖維化細胞模型是否建立成功。

2.如權利要求1所述的用于研究藥物吸收的心肌纖維化細胞模型的建立方法，其特征在于，所述高糖DMEM培養液是將FBS 120ml、100×天門冬氨酸15ml、青霉素160000單位和鏈霉素200mg溶于900ml DMEM高糖培養基中所得的培養液。

3.如權利要求1所述的用于研究藥物吸收的心肌纖維化細胞模型的建立方法，其特征在于，所述步驟(1)中培養條件是指溫度為37℃，濕度為80-90％。

4.如權利要求1所述的用于研究藥物吸收的心肌纖維化細胞模型的建立方法，其特征在于，所述步驟(2)中心肌成纖維細胞模型的構建方法是指首先采用高糖DMEM培養液將步驟(1)所得的心肌成纖維細胞制成5×10⁵個/ml的懸液；然后將心肌成纖維細胞接種于所述24孔板Transwell小室的濾膜上，并控制接種濃度為1×10⁴-1.2×10⁴個/cm²，培養28-35天即可。

5.如權利要求1所述的用于研究藥物吸收的心肌纖維化細胞模型的建立方法，其特征在于，所述HBSS培養液是將10g/L NaCl、30mg/L KH₂PO₄、48mg/L NaHPO₄、1.2g/L葡萄糖溶于hank's液，并用質量濃度為1％的HCl溶液或質量濃度為5％的NaOH溶液調整pH值至7.2的溶液。

6.如權利要求1所述的用于研究藥物吸收的心肌纖維化細胞模型的建立方法，其特征在于，所述步驟(5)中HBSS培養液中PDGF的濃度為20-50ng/mL。

7.如權利要求1所述的用于研究藥物吸收的心肌纖維化細胞模型的建立方法，其特征在于，所述心肌纖維化細胞模型的吸光度值的測定方法是向待測細胞中加入10mg/ml的MTT溶液，3h后棄去培養基中的上清液，每孔加入DMSO 100μL，于室溫以50rpm轉速水平回旋震搖，30min后用酶標儀測定490nm波長處的吸光度。