[發(fā)明專利]一種用于檢測禽腺病毒血清4型的RPA引物及其檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710652796.2
• 申請日: 2017-08-02
• 公開（公告）號: CN107385110B
• 公開（公告）日: 2018-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙軍;王川慶;萬文妍;劉延珂;楊霞;常洪濤;王新衛(wèi);陳陸;高冬生;王永生
• 申請（專利權(quán)）人: 河南農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 陳大通

本發(fā)明公開了一種用于檢測禽腺病毒血清4型的RPA引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明還公開了一種用于檢測禽腺病毒血清4型的RPA方法，該方法主要包括：引物合成、待測樣品DNA提取、RPA擴增反應(yīng)和RPA擴增產(chǎn)物分析等步驟。本發(fā)明的RPA引物特異性強，靈敏度高，檢測結(jié)果準確。本發(fā)明的檢測方法操作簡單，穩(wěn)定性好，為有效檢測和鑒定雞肝炎?心包積液綜合征提供一種成本低、快速、特異的現(xiàn)場診斷方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學檢測領(lǐng)域，具體涉及用于檢測禽腺病毒血清4型的RPA引物及其檢測方法。

背景技術(shù)

禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype4，F(xiàn)AdV-4)引起的雞肝炎-心包積液綜合癥是高度傳染性疾病，該病主要發(fā)生于3-10周齡肉雞，4-5周齡為死亡高峰期，死亡率最高可達80％，為我國養(yǎng)禽業(yè)帶來很大的經(jīng)濟損失。對此病進行快速的現(xiàn)場診斷，能夠為疫病的有效防控爭取寶貴時間，最大限度地減少損失和疫病擴散的風險。

目前檢測禽腺病毒的方法主要有病毒分離鑒定、中和試驗、電子顯微鏡法、瓊脂擴散試驗、ELISA、PCR等。病毒分離鑒定和病毒中和試驗需要特定的細胞培養(yǎng)，耗時長；電子顯微鏡需要昂貴的儀器且不能確定病毒血清型；瓊脂擴散試驗的敏感性不夠高；ELISA通常用于測定特定腺病毒的抗體反應(yīng)，操作步驟繁瑣，同時也需要特定的儀器；常規(guī)的聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)以其能夠檢測痕量的病原DNA而一直被作為診斷多種疫病的金標方法。但PCR需要特殊的熱循環(huán)設(shè)備、低溫保存的試劑和避免交叉污染的技術(shù)操作要求。現(xiàn)有的禽腺病毒檢測方法由于這樣或那樣的缺陷而無法滿足疫病現(xiàn)場診斷的需求。研究和開發(fā)適合用于禽腺病毒血清4型現(xiàn)場診斷的技術(shù)對于有效控制禽腺病毒血清4型(FAdV-4)引起的雞肝炎-心包積液綜合癥具有重要意義。

重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技術(shù)是由英國公司TwistDx Inc開發(fā)的一種可以替代傳統(tǒng)PCR的新型核酸檢測技術(shù)。RPA技術(shù)主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶(Recombinase)、單鏈結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶(Polymerase)。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應(yīng)溫度在37℃-42℃左右。重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動DNA合成，對模板上的目標區(qū)域進行指數(shù)式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合，防止進一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進行得非常快，一般可在十分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴增產(chǎn)物。該技術(shù)對硬件設(shè)備的要求很低，特別適合用于現(xiàn)場診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。RPA技術(shù)具有不同于常規(guī)PCR的諸多優(yōu)點：1)RPA反應(yīng)在常溫下即可進行；2)RPA檢測的靈敏度很高；3)既可用于DNA，也可用于RNA的擴增；4)可以進行多重擴增。