[發明專利]一種用于檢測胞內勞森菌的RPA引物及其檢測方法

有效

• 申請號: 201710652790.5
• 申請日: 2017-08-02
• 公開（公告）號: CN107385047B
• 公開（公告）日: 2018-08-24
• 發明（設計）人: 趙軍;王川慶;吳艷陽;李永濤;常洪濤;陳陸;高冬生;王永生
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;G01N33/569;C12R1/01
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 陳大通

本發明公開了一種用于檢測胞內勞森菌的RPA引物，所述RPA引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，該RPA引物特異性強，靈敏度高，檢測結果準確。本發明還提供了一種用于檢測胞內勞森菌的RPA方法，該方法包括引物合成、待測樣品中DNA的提取、RPA擴增及擴增產物分析等步驟，該檢測方法操作簡單，穩定性好，為有效檢測和鑒定豬增生性腸炎提供一種成本低、快速、特異的現場診斷方法。

技術領域

本發明屬于分子生物學檢測領域，具體涉及一種用于檢測胞內勞森菌的RPA引物及其檢測方法。

背景技術

胞內勞森菌(Lawsoniaintracellularis，LI)引起豬的增生性腸炎，該病潛伏期較長，感染動物臨床通常不表現明顯癥狀，容易通過引種而將該病引入健康豬群，給疫病的診斷和防控帶來很大困難。對復雜的疫病進行快速的現場診斷，能夠為疫病的有效防控爭取寶貴時間，最大限度地減少損失和疫病擴散的風險。

常規的聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術以其能夠檢測痕量的病原DNA而一直被作為診斷多種疫病的金標方法。但PCR需要特殊的熱循環設備、低溫保存的試劑和避免交叉污染的技術操作要求，從而限制了PCR在現場診斷中的應用。重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技術是由英國公司TwistDx Inc開發的一種可以替代傳統PCR的新型核酸檢測技術。RPA技術主要依賴于三種酶：能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶(Recombinase)、單鏈結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶(Polymerase)。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應溫度在37℃-42℃左右。重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發生鏈交換反應形成并啟動DNA合成，對模板上的目標區域進行指數式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結合，防止進一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進行得非常快，一般可在十分鐘之內獲得可檢出水平的擴增產物。該技術對硬件設備的要求很低，特別適合用于現場診斷、獸醫、食品安全、生物安全、農業等領域。RPA技術具有不同于常規PCR的諸多優點：1)RPA反應在常溫下即可進行；2)RPA檢測的靈敏度很高；3)既可用于DNA，也可用于RNA的擴增；4)可以進行多重擴增。

免疫膠體金技術(Immune colloidal gold technique)是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術，英文縮寫為：GICT。膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩定的膠體狀態，稱為膠體金。膠體金在弱堿環境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合，由于這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。膠體金除了與蛋白質結合以外，還可以與許多其它生物大分子結合，如SPA、PHA、ConA等。根據膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應，加上結合物的免疫和生物學特性，因而使膠體金廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。膠體金免疫層析法是將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標記試劑(抗體或單克隆抗體)吸附在結合墊上，當待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細作用向前移動，溶解結合墊上的膠體金標記試劑后相互反應，再移動至固定的抗原或抗體的區域時，待檢物與金標試劑的結合物又與之發生特異性結合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結果。該法現已發展成為診斷試紙條，使用十分方便。

胞內勞森菌感染豬引起增生性腸炎，潛伏期較長，感染動物臨床通常不表現明顯癥狀，容易通過引種而將該病引入健康豬群。目前對于該病的診斷主要是通過PCR進行，不僅耗時較長，且需要一定的儀器設備，無法給臨床控制疫病提供及時的指導。因此，迫切需要尋找一種胞內勞森菌的現場快速檢測診斷技術。

發明內容