[發明專利]一種葡萄糖二酸的制備方法及其制備中的糖醛酸脫氫酶-NADH氧化酶和應用

有效

• 申請號: 201710651838.0
• 申請日: 2017-08-02
• 公開（公告）號: CN107365806B
• 公開（公告）日: 2020-04-03
• 發明（設計）人: 薛業敏;李亞賢;張宗慧
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: C12P7/58
• 分類號: C12P7/58;C12N9/02
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 孫斌

1.一種葡萄糖二酸的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)從木質纖維植物中提取的木聚糖為原料；

(2)將步驟(1)制備的木聚糖加入到耐高溫木聚糖酶和α-葡萄糖醛酸酶混合酶液中，進行水解反應，水解結束后加入乙醇進行沉淀除雜，然后取上清液經濃縮即得到葡萄糖醛酸；

(3)向步驟(2)制備的葡萄糖醛酸中加入含有尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸和雙功能性糖醛酸脫氫酶-NADH氧化酶混合反應液進行酶氧化反應；

(4)氧化反應結束后，反應液經弱堿性環氧樹脂吸附分離后即可得葡萄糖二酸；

所述耐高溫木聚糖酶為來源于海棲熱袍菌Thermotiga maritima的GH10木聚糖酶基因(TmXynB)；所述α-葡萄糖醛酸酶為來源于海棲熱袍菌T.maritima的GH67α-葡萄糖醛酸酶基因(TmAguA)；所述糖醛酸脫氫酶-NADH氧化酶由嗜熱雙孢菌Thermobispora bispora嗜熱雙孢菌糖醛酸脫氫酶(TbUDH)基因通過Linker連接著海棲熱袍菌Thermotiga maritima NADH氧化酶(TmNOX)基因組成并經密碼子優化獲得，所述糖醛酸脫氫酶-NADH氧化酶其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述木質纖維植物為硬木、軟木或禾本科植物。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述木聚糖與混合酶液的木聚糖濃度為10-100mg/mL，混合酶液pH為4.0-7.5；酶液中耐高溫木聚糖酶活性為1-20U/mL，α-葡萄糖醛酸酶活性為0.2-5.0U/mL。

4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述水解反應溫度60℃～90℃，時間40min～10h。

5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述混合反應液中葡萄糖醛酸濃度為0.16～10.0mg/mL；反應液pH為6.0-8.2，反應液中糖醛酸脫氫酶活性為0.1-5U/mL，NADH氧化酶活性為0.1-5U/mL。

6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述混合反應液中尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸濃度為0.2-2.0mM。

7.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述酶氧化反應溫度30℃～65℃，時間40min～2.0h。

8.一種權利要求1所述的制備方法中所使用的雙功能性糖醛酸脫氫酶-NADH氧化酶，其特征在于，所述雙功能性糖醛酸脫氫酶-NADH氧化酶為尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴型酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

9.一種權利要求1所述的制備方法中所使用的雙功能性糖醛酸脫氫酶-NADH氧化酶，其特征在于，所述雙功能性糖醛酸脫氫酶-NADH氧化酶的基因的堿基序列如SEQ ID NO.3所示。

10.一種權利要求1所述的制備方法中所使用的雙功能性糖醛酸脫氫酶-NADH氧化酶在氧化葡萄糖醛酸生成葡萄糖二酸中的應用。