[發明專利]一種堿性蛋白酶及其基因和應用

有效

• 申請號: 201710651096.1
• 申請日: 2017-08-02
• 公開（公告）號: CN107384897B
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發明（設計）人: 吳培均;李富偉;張士彬;羅建杰
• 申請（專利權）人: 北京科為博生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/54
• 分類號: C12N9/54;C12N15/57;C12N15/75;C12N1/21
• 代理公司: 北京方安思達知識產權代理有限公司 11472
• 代理人: 陳琳琳;武玥

本發明屬于生物工程領域，具體地，本發明涉及一種堿性蛋白酶及其基因和應用。本發明的堿性蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發明的堿性蛋白酶基因，其堿基序列如SEQ ID NO.2所示。本發明還提供了包含所述堿性蛋白酶基因的重組載體，以及包含所述堿性蛋白酶基因的重組菌株。本發明運用基因工程技術構建了含有堿性蛋白酶基因的重組質粒，并在解淀粉芽孢桿菌中實現了堿性蛋白酶的高效表達。構建的堿性蛋白酶重組菌株具有較高的應用價值，具有很高的產堿性蛋白酶的能力，在同等發酵條件下，較野生菌酶活提高了約55％。

技術領域

本發明涉及生物工程領域，具體地，涉及一種堿性蛋白酶及其基因和應用。

背景技術

堿性蛋白酶又被稱為絲氨酸蛋白酶，屬于蛋白酶類，其最適pH在9～11，在pH5～10時比較穩定。堿性蛋白酶主要用于洗滌工業，在食品、醫療、釀造、絲綢、制革等領域也有廣泛的應用。

堿性蛋白酶最早發現于豬的胰臟中。1913年，Rohm首先將胰蛋白酶用于洗滌浸泡劑。1945年，瑞士的Dr.Jaag等發現微生物來源的堿性蛋白酶，使得蛋白酶廣泛應用于洗滌劑工業成為可能。目前，蛋白酶是工業用酶中占比最大的酶類，約占全世界每年總銷量的60％左右，其中堿性蛋白酶約占25％。因此堿性蛋白酶具有重大的商業價值與開發潛力。

相較于國外，雖然我國酶制劑工業快速發展，但是仍然存在一定差距。目前堿性蛋白酶市場需求量比較大，但是現有堿性蛋白酶生產菌株的生產水平有待提高，亟待研發出堿性蛋白酶的高效表達菌株。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種堿性蛋白酶及其基因、工程菌(重組菌株)和制備方法。

本發明的另一目的提供上述堿性蛋白酶及基因工程菌的應用。

本發明從地衣芽孢桿菌CRVAB300(Bacillus licheniformis)中分離得到一種新的堿性蛋白酶。

本發明提供了一種堿性蛋白酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

本發明中的堿性蛋白酶，具有良好的熱穩定性以及pH穩定性。其最適溫度為40℃，在35～60℃之間相對酶活為80％以上。在40～50℃條件下保溫1h，剩余酶活在70％以上，甚至在50℃保溫2h后仍有60％的剩余酶活；重組堿性蛋白酶最適pH為10.5，在pH9～11之間相對酶活達到80％以上。其在pH7～11范圍內耐受1h剩余酶活力達到90％以上。

本發明提供了編碼上述堿性蛋白酶的基因。具體地，該基因的堿基序列如SEQ IDNO.2所示：

本發明通過PCR的方法分離克隆了所述堿性蛋白酶的編碼基因，DNA全序列分析結果表明，堿性蛋白酶的編碼基因全長1137bp。將堿性蛋白酶的編碼基因經序列比對后發現與GENBANK ACCESSION Number為HM147766.1的堿性蛋白酶基因相似度達91％。

本發明還提供了包含上述堿性蛋白酶基因的重組載體，優選為包含權利要求2或3所述堿性蛋白酶基因的質粒pwB980。所述重組質粒pwB980還含有kan抗性基因、P43啟動子序列、SPsacB信號肽序列、枯草芽孢桿菌終止子序列；本發明所述堿性蛋白酶基因位于重組質粒pwB980的SPsacB信號肽序列和枯草芽孢桿菌終止子序列之間。

本發明還提供了包含上述堿性蛋白酶基因的重組菌株，優選所述重組菌株為解淀粉芽孢桿菌K1。

本發明還提供了一種制備上述堿性蛋白酶的方法，包括以下步驟：

1)用上述包含本申請中上述堿性蛋白酶編碼基因的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；