[發(fā)明專利]高通量鑒定甜瓜雜交種純度的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710651057.1
• 申請日: 2017-08-02
• 公開（公告）號: CN107236819A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 許勇;張海英;宮國義;孫宏賀;郭紹貴;張潔;任毅;李茂營
• 申請（專利權(quán)）人: 北京市農(nóng)林科學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11245
• 代理人: 關(guān)暢,張立娜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于蔬菜育種與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種高通量鑒定甜瓜雜交種純度的方法。

背景技術(shù)

甜瓜是傳統(tǒng)的特色水果和瓜農(nóng)就業(yè)增收的主要經(jīng)濟(jì)作物。甜瓜雜交種的種子純度是種子質(zhì)量的核心指標(biāo)，隨著甜瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和生產(chǎn)的需求，越來越多的優(yōu)質(zhì)、抗病新品種涌入市場，但由于雜交種子中混入了母本種子導(dǎo)致純度不達(dá)標(biāo)，引起的種子糾紛時有發(fā)生，給瓜農(nóng)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，因此為了保護(hù)育種者、種子經(jīng)營者及瓜農(nóng)的利益，研究并建立快速、準(zhǔn)確有效的種子純度鑒定方法是非常重要的。

在眾多分子標(biāo)記技術(shù)中，SSR技術(shù)因其多態(tài)性高、操作簡便、結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點，在甜瓜、黃瓜、西瓜等瓜類作物的雜交種純度鑒定方面得到了廣泛應(yīng)用。甜瓜核基因組SSR標(biāo)記呈現(xiàn)共顯性遺傳方式，電泳檢測時，F(xiàn)₁帶型為雙親互補帶型，只能通過單株檢測才能顯示F₁種子中混入的母本種子，工作量較大。而在甜瓜雜交種子純度鑒定工作中，母本株通常較少，如果能夠通過混合樣品檢測就可顯示母本的有無，從而迅速判定混合樣品的整體純度，將大幅度減少工作量，顯著提高工作效率，因此，急需尋找能夠進(jìn)行混合樣品分析的分子標(biāo)記技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種高通量鑒定甜瓜雜交種純度的方法。

本發(fā)明提供了一種高通量鑒定甜瓜品種A的雜交種中是否混有其母本自交種的方法，其原理在于：甜瓜的線粒體基因組呈現(xiàn)獨特的父系遺傳特性。電泳檢測時，純合的F₁帶型和父本帶型一樣；如果F₁帶型是雙親帶型，將表示F₁種子中混入了母本種子。該方法具體可包括如下步驟：

(A1)從待測甜瓜種子中隨機選取若干數(shù)目的種子，提取基因組DNA，混合后形成混合樣本DNA；

(A2)以步驟(A1)所得混合樣本DNA作為模板，采用根據(jù)甜瓜線粒體基因組開發(fā)的SSR引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；

(A3)將步驟(A2)所得擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，根據(jù)電泳譜圖按照如下確定所述待測甜瓜種子是否均為甜瓜品種A的雜交種：若所述電泳圖譜上具有所述甜瓜品種A的父本的特征譜帶且不具有所述甜瓜品種A的母本的特征譜帶，則所述待測甜瓜種子均為所述甜瓜品種A的雜交種，不含其母本自交種；若所述電泳圖譜上同時具有所述甜瓜品種A的父本的特征譜帶和所述甜瓜品種A的母本的特征譜帶，則所述待測甜瓜種子中除了所述甜瓜品種A的雜交種外混有其母本自交種。

所述待測甜瓜種子為所述甜瓜品種A的雜交種，或者所述甜瓜品種A的雜交種與其母本自交種的混合。

在所述方法的步驟(A1)中，所述若干數(shù)目可為大于等于2且小于50的整數(shù)(如20-40)。

進(jìn)一步，在本發(fā)明的一個實施例中，所述若干數(shù)目具體為20，即步驟(A1)中，每20個種子一混合。

在所述方法中，所述凝膠電泳具體為聚丙烯酰胺凝膠電泳；如非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；更加具體如8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。

在本發(fā)明中，所述8％非變性聚丙烯酰胺溶液具體由20ml ddH₂O、4ml 10×TBE、16ml 20％(質(zhì)量百分比)Acr-Bis、40μl TEMED、400μl 10％(質(zhì)量百分比)AP配制而成。

在所述方法中，將所述擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，220V穩(wěn)壓電泳直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至可以使擴(kuò)增DNA片段能夠被清楚識別的距離時，停止電泳；銀染法染色，拍照記錄特征譜帶。

在所述方法中，從種子中提取基因組DNA具體為從種子所發(fā)幼芽中提取基因組DNA。更加具體的，為：將待測樣品種子35℃發(fā)芽3-4天，取1cm左右的幼芽，分別裝入2ml離心管，加入0.1M的NaOH溶液100μl，用組織搗碎儀打碎樣品，沸水水浴1min左右，加入pH 8.0的Tris-HCl緩沖液1ml，充分混勻，得待測樣品基因組DNA，4℃下保存?zhèn)溆谩?!-- SIPO -->

在所述方法中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的反應(yīng)體系如下：基因組DNA 20ng、含Mg²⁺的10×buffer 1.25μl，dNTP 0.2mmol·L^-1 1μl，上下游引物0.25mmol·L^-1各1μl，Taq酶5U·μL^-10.2μl，ddH₂O補足至12.5μl。