[發明專利]野生稻響應稻褐飛虱取食的體內激素信號相關基因的檢測引物

有效

• 申請號: 201710648989.0
• 申請日: 2017-08-01
• 公開（公告）號: CN107746892B
• 公開（公告）日: 2021-04-23
• 發明（設計）人: 劉勇波;劉方;李俊生;徐晗
• 申請（專利權）人: 中國環境科學研究院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 北京知本村知識產權代理事務所(普通合伙) 11039
• 代理人: 劉江良

本發明提供了一種基于qRT?PCR鑒定野生稻響應稻褐飛虱取食后體內激素信號相關基因轉錄量變化的若干引物序列，該引物跨基因內含子設計，確保只擴增野生稻cDNA上的相應序列。利用本發明提供的特異性、跨內含子的引物可實現對野生稻響應稻褐飛虱取食后激素信號相關基因轉錄水平變化的準確檢測，可有效去除核基因擴增的污染，為野生稻響應稻褐飛虱取食的分子機理研究提供了可靠的方法。

技術領域

本發明屬于生物技術檢測領域，尤其涉及野生稻經稻褐飛虱取食后體內激素信號相關基因轉錄水平的檢測。

背景技術

稻褐飛虱(Nilaparvata lugens Stal.)屬同翅目飛虱科(Homoptera:Delphacidae)昆蟲，是我國和亞洲水稻生產中的主要害蟲。褐飛虱危害水稻途徑可分為二個方面，直接危害和間接危害。直接危害是褐飛虱成蟲、若蟲直接吸食水稻造成的危害，在稻叢下部刺吸汁液，消耗稻株養分。研究發現，水稻受褐飛虱取食后，組織中化學成分改變，葉綠素、可溶蛋白含量、蛋白酶活性和水分均降低，嚴重時水稻倒伏、枯萎，造成減產。間接危害是褐飛虱產卵刺傷植物組織以及傳播或誘發水稻其他病害的發生。如何防止褐飛虱的大規模爆發和提高栽培稻在逆境脅迫下的產量和質量，一直是科研工作者的研究目標。殺蟲劑技術難度大、成本高且污染環境，所以研究水稻抗蟲的分子機理，篩選克隆抗性基因，改良栽培稻品種，是提高水稻抗蟲十分必要的方法。

在自然環境中，植物持續暴露于各種非生物和生物脅迫中。為了生存，植物進化出了錯綜復雜的機制來感知外界信號，并選擇最優的應對方式。當植物感知到這些脅迫后，體內的激素、活性氧、激酶和相關的轉錄因子會相互配合組成響應的網絡，來幫助植物應對這些外界的脅迫。昆蟲取食植物誘導植物細胞里發生一系列分子事件，轉換成警報信號，然后產生并富集一些防御性的代謝產物。植物對昆蟲取食的誘導型防御分為三個階段，感知階段、信號傳遞階段和代謝產物的生物合成階段。一些小分子和蛋白已被發現并認為在抗蟲防御信號傳遞階段起重要作用，包括Ca²⁺、蛋白激酶(MAPKs)、活性氧族(ROS)和植物激素。植物激素在植物響應外界脅迫的傳遞網絡中扮演著至關重要的角色，這些激素信號錯綜復雜、相互協同或拮抗，共同調節植物對外界環境的應答。參與抵御生物脅迫的激素主要包括水楊酸(SA)、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)。

發明內容

結合目前研究和前期工作，本發明人在兩種野生稻中利用數字表達分析譜篩選了經褐飛虱取食后，轉錄水平變化顯著且與激素信號途徑相關的基因。使用qRT-PCR方法檢測這些基因在兩種野生水稻中的相對轉錄量，為進一步研究水稻抗蟲的分子機理和野生稻資源開發利用提供依據。

本發明的目的是提供引物用于檢測經稻褐飛虱取食后野生稻體內激素信號相關基因轉錄水平的變化，本發明引物跨內含子設計，特異性高，可消除基因組擴增的影響，使用qRT-PCR技術進行野生稻體內激素信號相關基因的轉錄水平檢測。

本發明所提供的的技術方案是：

一種檢測野生稻響應稻褐飛虱取食的體內激素信號相關基因轉錄水平的方法，其特征在于：所述相關基因為基因ERF1(ethylene-responsive transcription factor 1)、GID1(gibberellin receptor)、DELLA(aspartic acid–glutamic acid–leucine–leucine–alanine)、PBS1(serine/threonine-protein kinase)、CALM(calmodulin)、TGA(transcription factor TGA)、BAS1(PHYB activation tagged suppressor 1)、或/和ARF(auxin response factor)，該方法是提取待測野生稻葉片總RNA，以所述相關基因的特異性引物對待測樣品進行qRT-PCR檢測，所述特異性引物如下：

進一步地，所述的檢測方法，所述引物的用量及退火溫度如下：