[發明專利]一種腫瘤血管阻斷劑融合蛋白的純化方法

有效

• 申請號: 201710647036.2
• 申請日: 2017-08-01
• 公開（公告）號: CN107400169B
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發明（設計）人: 史權威;潘向輝;李延虎;楊子義
• 申請（專利權）人: 北京華安科創生物技術有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/14;A61K38/17;A61K47/64;A61P35/00
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;陳征

本發明提供一種腫瘤血管阻斷劑融合蛋白的純化方法，本發明方法是將大腸桿菌表達的、以包涵體形式存在的腫瘤血管阻斷劑融合蛋白的發酵菌體通過高壓均質機破碎、高速離心，得到粗制包涵體。用不同洗滌溶液洗滌，得到較凈的包涵體，然后經過8M尿素變性溶解包涵體，離心取上清，再用透析法復性。復性后樣品經過離子交換、分子篩柱純化后，得到的目的蛋白SDS?PAGE電泳純度和RP?HPLC純度均能達到95％以上。本發明提供的純化方法簡便，成本低，易操作，易于產業化生產。

技術領域

本發明涉及蛋白純化技術領域，具體地說，涉及一種從大腸桿菌表達的以包涵體形式存在的一種腫瘤血管阻斷劑融合蛋白的純化方法。

背景技術

表達外源基因的宿主細胞，在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細胞內，或被膜包裹或形成無膜裸露結構，從而形成包涵體。這種表達方式具有成本低、產量高、不易被降解、容易純化等優點，成為當今外源蛋白主要的表達方式。以大腸桿菌菌株為代表的原核表達系統，在短時間內能以低成本獲得大量表達蛋白，表達載體帶有強的啟動子，在IPTG誘導下可高效表達，快速的蛋白合成使產物大量堆積，以致于沒有足夠的時間進行正確的折疊和二硫鍵的配對，形成包涵體沉淀。

包涵體的提取方法已較為成熟，但是它卻引入了一個變性-復性過程。目前對于包涵體蛋白的純化方法主要有：①將表達獲得的包涵體進行變性，獲得再折疊的可溶性蛋白，并采用親和柱對其進行純化，將純化得到的目的蛋白再復性使其重新折疊；②蛋白在重新折疊過程中容易受一些復性條件的影響而發生沉淀，那么對于這些蛋白可以對其表達條件進行摸索，找到其可溶表達的條件，然后再進行直接純化。影響復性的因素很多，首先是蛋白分子自身的理化特性，其次是目的蛋白質的濃度及復性體系的離子強度、pH值、溫度，另外從變性體系到復性體系的轉換速度也是重要的影響因素。很多蛋白質的復性過程很難控制，往往會形成蛋白沉淀，一些蛋白質甚至通過稀釋或透析方法完全轉換為復性體系后，由于環境的改變，而再次出現沉淀。

包涵體在變性前通常要用洗滌液多次清洗以便除去雜質。缺點在于：因反復洗滌，耗時長、往往易損失目的蛋白，造成回收率低，甚至純度不高等。包涵體變性一般用強的變性劑如尿素(6-8M)、鹽酸胍(GdnHCl 6M)，通過離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白質分子內和分子間的各種化學鍵，使多肽伸展。另外，對于含有半胱氨酸的蛋白質，分離的包涵體中通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內的非活性二硫鍵。還需加入還原劑，實現蛋白結構的重折疊，從而使目的蛋白形成正確的空間結構，恢復其生物活性。如巰基乙醇、二硫基蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸。還原劑的使用濃度一般是50-100mmol/L 2-BME或DTT。包涵體的復性是蛋白折疊恢復天然構象及活性的過程。蛋白質的立體結構其伸展肽鏈折疊為天然活性結構的過程受到周圍環境等諸多因素的影響。一般認為,蛋白質在復性過程中涉及兩種疏水相互作用,一是分子內的疏水相互作用,二是部分折疊的肽鏈分子間的疏水相互作用。前者促使蛋白質正確折疊,后者導致蛋白質聚集而無活性,兩者互相競爭,影響蛋白質復性效率。因此,在復性過程中,抑制肽鏈間的疏水相互作用以防止聚集,是提高復性效率的關鍵。

本發明的腫瘤血管阻斷劑融合蛋白屬于一種腫瘤血管阻斷劑多肽、可用于制備治療腫瘤的藥物。該蛋白從N端到C端依次包括：截斷的組織因子tTF的氨基酸序列、連接子和腫瘤靶向分子pHLIP的氨基酸序列。腫瘤血管阻斷劑多肽能夠通過pHLIP定位到腫瘤血管內皮細胞表面，從而特異的在腫瘤血管產生血栓，阻斷腫瘤部位血液供應，從而達到治療腫瘤的目的。本發明所述的腫瘤血管阻斷劑融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

發明內容

本發明的目的是提供一種純化效率高的融合蛋白的純化方法。

本發明的純化方法，包括如下步驟：

(1)破菌：能夠表達融合蛋白的菌體加入溶解液攪拌破碎后，離心，取沉淀；

(2)沉淀：沉淀經三步洗滌，收集最后一步洗滌后的沉淀，得粗制包涵體；