[發(fā)明專利]用于檢測MTHFR基因多態(tài)性的引物對、探針及試劑盒

有效

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• 申請日: 2017-07-31
• 公開（公告）號: CN107267645B
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 金京勛;崔紅;易其;易梅仙
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州德臻生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 廣州華進聯(lián)合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 萬志香

本發(fā)明公開一種用于檢測MTHFR基因多態(tài)性的引物對、探針及試劑盒；所述試劑盒包括有：針對MTHFR基因c.677位點設(shè)計的堿基序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物，所述SEQ ID No.1的5’端第一個堿基具有氨基修飾基團，所述SEQ ID No.2的5’端第一個堿基具有氨基修飾基團；針對MTHFR基因c.677位點設(shè)計的堿基序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的探針，所述SEQ ID No.3的一個堿基具有氨基修飾基團，所述SEQ ID No.4的一個堿基具有氨基修飾基團。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明試劑盒可以顯著縮短檢測所需時間，減少非特異性擴增，可以檢測SNPs和點突變，降低設(shè)計難度和檢測成本,并且不影響診斷精度，實現(xiàn)單一反應(yīng)管無開蓋檢測突變的方法，最大限度的避免氣溶膠污染，方便臨床使用，減少操作導(dǎo)致的誤差。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測MTHFR基因多態(tài)性的引物對、探針及試劑盒。

背景技術(shù)

聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。熒光PCR(qPCR)檢測，是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)發(fā)展的實時檢測技術(shù)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析或根據(jù)熒光信號累積檢測目標基因。該技術(shù)實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，到21世紀初已得到廣泛應(yīng)用。

PCR檢測方法雖然具有快速特點，但是其快速是相對于其他檢查，如培養(yǎng)，目前國內(nèi)外門診檢測越來越需要更快出結(jié)果，而目前的PCR技術(shù)每個循環(huán)需要加熱冷卻，達到快速PCR目的的方法主要集中在縮短加熱冷卻時間，縮短時間效果有限，PCR反應(yīng)本身需要每個循環(huán)75秒左右時間，為了縮短檢測時間，只能減少循環(huán)數(shù)，導(dǎo)致快速PCR靈敏度降低。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)，主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性,SNPs作為第三代遺傳標記，具有已知性、可遺傳性、可檢測性，用于疾病基因的定位、克隆和鑒定，SNPs還影響機體的生理特征、藥物代謝能力、病理條件,常用于研究或診斷疾病的易感性、個性化醫(yī)療，比如MTHFR基因677位點的SNPs與葉酸代謝相關(guān)，以MTHFR677位點野生型C/C純合子代謝葉酸能力為100％時雜合子C/T型的代謝能力為65％，突變型純合子T/T代謝能力為30％，而葉酸代謝和同型半胱氨酸代謝密切相關(guān)，和先天性畸形、高血壓等疾病關(guān)系密切。

點突變是基因突變的一種，指只有一個堿基對發(fā)生改變。廣義點突變可以是堿基替換，單堿基插入或堿基缺失；狹義點突變也稱作單堿基替換(base substitution)。堿基替換又分為轉(zhuǎn)換(transitions)和顛換(transversions)兩類。點突變具有很高的回復(fù)突變率。

點突變和腫瘤發(fā)生關(guān)系密切,如非小細胞肺癌-腺癌患者中表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor:EGFR)基因出現(xiàn)突變患者占據(jù)30％多,隨著靶向藥物的出現(xiàn),檢測靶向藥物有效突變可以有效地分配醫(yī)療資源,使醫(yī)療有的放矢,減少浪費。

目前檢測SNPs或點突變的方法主要有：1)PCR-SSCP法；2)異源雙鏈分析法(HA)；3)突變體富集PCR法(mutant-enriched PCR)；4)等位基因特異性寡核苷酸分析法(allele-specific oligonucleotide,ASO)；5)DNA芯片技術(shù)(DNA chip)；6)突變擴增系統(tǒng)(amplification refractory mutation system,ARMS)；7)焦磷酸測序法等方法。