[發明專利]基于納米抗體檢測氟蟲腈殘留的ELISA試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201710642193.4
• 申請日: 2017-07-31
• 公開（公告）號: CN107607703B
• 公開（公告）日: 2019-06-04
• 發明（設計）人: 許艇;王楷;林優優;劉志平;李季;布魯斯·杜普里·哈莫克
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;G01N33/535
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

本發明公開了基于納米抗體檢測氟蟲腈殘留的ELISA試劑盒及其應用，所述試劑盒包括盒體、設在盒體內的酶標板以及試劑；其中，酶標板的每個孔包被有氟蟲腈包被抗原，所述試劑包括抗氟蟲腈納米抗體、氟蟲腈標準溶液、酶標記的二抗、緩沖液PBS、洗滌液PBST、底物液、顯色液和反應終止液等。檢測過程中，酶標板孔壁上吸附的包被抗原和待測氟蟲腈相互競爭與抗體反應，通過顯色反應觀察結果。檢測已知濃度的氟蟲腈并繪制標準曲線，可以推算出待測氟蟲腈的濃度。本發明的優點是能準確靈敏地檢測水、蔬菜中氟蟲腈殘留，樣品的前處理過程簡單，耗時少，能同時檢測大量的樣品，樣品檢測成本遠低于傳統的儀器檢測方法。

技術領域

本發明涉及基因工程、噬菌體展示技術以及ELISA檢測技術領域，具體地說，涉及基于納米抗體檢測氟蟲腈殘留的ELISA試劑盒及其應用。

背景技術

氟蟲腈(Fipronil)又名芬普尼、銳勁特、非潑羅尼，是一種應用較為廣泛的帶有三氟甲基磺酰基團的N-苯基吡唑類殺蟲劑，對危害糧、棉、油、果蔬、茶葉等主要農作物的害蟲都有良好的防治效果。在農藥的使用過程中，很多害蟲對機磷農藥、氨基甲酸酯類農藥和擬除蟲菊酯類殺蟲劑產生抗性。對于此類抗性昆蟲，氟蟲腈亦有較好的效果。氟蟲腈對水產、蜜蜂、家蠶、嚙齒類動物、鳥類均有毒性較大，對哺乳動物的毒性中等，氟蟲腈會損害人類β3GABAA受體亞單位導致人類神經發育障礙，如自閉癥、安格爾曼綜合征、癲癇等。由于氟蟲腈常用于寵物身上，在人類和寵物接觸的過程中同樣存在風險。由于在有毒環境中的暴露，有可能會兒童和胎兒的大腦和神經系統發育。

在甲胺磷、對硫磷等高毒有機磷殺蟲劑被限制或禁止使用之后，自2009年起，農業部規定氟蟲腈除作為衛生及種子包衣劑等，限制田間使用。雖然氟蟲腈已經被限用，但仍有違規現象發生。一些農藥銷售公司將氟蟲腈用于農作物的使用宣傳，或將其非法添加于其他農藥已達到良好的防蟲效果。由于氟蟲腈半衰期較長、易殘留，環境和食品中殘留超標問題逐漸引起關注。因此，加強氟蟲腈殘留的檢測，對于科學合理地使用氟蟲腈，保障食品安全和人類健康，減少環境污染，增強我國農副產品的國際競爭力，保持我國農業的可持續發展等具有重要意義。

目前已報道的氟蟲腈殘留檢測方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)和色譜-質譜聯用(GC/LC-MS)。運用這些方法需要專業化的實驗室、專用儀器設備及專業操作人員，樣品前處理復雜，分析成本高，難以滿足大量樣本現場快速監測的需要。20世紀90年代以來，快速發展的免疫分析技術已被應用于農藥殘留分析和環境監測，具有簡便快速、廉價高效、特異性強、靈敏度高等優點。

基于常規抗體(多克隆抗體和單克隆抗體)的氟蟲腈殘留酶聯免疫吸附分析方法穩定性相對較低，本發明以抗氟蟲腈納米抗體為基礎，采用酶聯免疫吸附分析方法，其熱穩定性均優于多克隆抗體免疫分析方法。

發明內容

本發明的目的是針對目前農藥殘留儀器分析方法成本高、前處理復雜、特異性差、靈敏度低和難以實驗現場檢測等不足，提供一種具有高特異性、高靈敏度、高準確度、高精確度、操作方法簡單，并能用于大批量樣品快速檢測的，分析氟蟲腈殘留的ELISA檢測試劑盒。適用于水、蔬菜等樣品中氟蟲腈殘留的快速測定。

為了實現本發明目的，本發明首先提供一條用于構建駝科動物噬菌體展示納米抗體文庫的C端通用PCR引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

繼而本發明提供一種抗氟蟲腈納米抗體，所述抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，將SEQ ID NO:1所示序列去掉末端6個組氨酸標簽后的氨基酸序列。