[發(fā)明專(zhuān)利]一種適用于三唑磷殘留分析的VHH-ELISA試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710641172.0
• 申請(qǐng)日: 2017-07-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107417790B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-07-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許艇;王楷;劉志平;林優(yōu)優(yōu);李季;布魯斯·杜普里·哈莫克
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07K16/44
• 分類(lèi)號(hào): C07K16/44;G01N33/543
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

本發(fā)明公開(kāi)了基于納米抗體檢測(cè)三唑磷殘留的ELISA試劑盒及其應(yīng)用，所述試劑盒包括盒體、設(shè)在盒體內(nèi)的酶標(biāo)板以及試劑；其中，酶標(biāo)板的每個(gè)孔包被有三唑磷包被抗原，所述試劑包括抗三唑磷納米抗體、三唑磷標(biāo)準(zhǔn)溶液、酶標(biāo)記的二抗、緩沖液PBS、洗滌液PBST、底物液、顯色液和反應(yīng)終止液等。檢測(cè)過(guò)程中，酶標(biāo)板孔壁上吸附的包被抗原和待測(cè)三唑磷相互競(jìng)爭(zhēng)與抗體反應(yīng)，通過(guò)顯色反應(yīng)觀察結(jié)果。檢測(cè)已知濃度的三唑磷并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，可以推算出待測(cè)三唑磷的濃度。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)水、蔬菜中三唑磷殘留，樣品的前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，耗時(shí)少，能同時(shí)檢測(cè)大量的樣品，樣品檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的儀器檢測(cè)方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程、噬菌體展示技術(shù)以及ELISA檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及基于納米抗體檢測(cè)三唑磷殘留的ELISA試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

三唑磷(Triazophos)是一種應(yīng)用較為廣泛的有機(jī)磷酸酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑，對(duì)危害糧、棉、油、果蔬、茶葉等主要農(nóng)作物的害蟲(chóng)都有良好的防治效果。三唑磷對(duì)魚(yú)類(lèi)、蜜蜂、家蠶毒性較大，對(duì)哺乳動(dòng)物的毒性中等，其進(jìn)入人體后會(huì)造成大量乙酰膽堿蓄積在神經(jīng)效應(yīng)器接點(diǎn)處，發(fā)生毒蕈堿樣、煙堿樣及中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。

在甲胺磷、對(duì)硫磷等高毒有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑被限制或禁止使用之后，三唑磷的使用量近年來(lái)迅速增加，由于半衰期較長(zhǎng)、易殘留，環(huán)境和食品中殘留超標(biāo)問(wèn)題逐漸引起關(guān)注。因此，加強(qiáng)三唑磷殘留的檢測(cè)，對(duì)于科學(xué)合理地使用三唑磷，保障食品安全和人類(lèi)健康，減少環(huán)境污染，增強(qiáng)我國(guó)農(nóng)副產(chǎn)品的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力，保持我國(guó)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展等具有重要意義。

目前已報(bào)道的三唑磷殘留檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC/LC-MS)。運(yùn)用這些方法需要專(zhuān)業(yè)化的實(shí)驗(yàn)室、專(zhuān)用儀器設(shè)備及專(zhuān)業(yè)操作人員，樣品前處理復(fù)雜，分析成本高，難以滿(mǎn)足大量樣本現(xiàn)場(chǎng)快速監(jiān)測(cè)的需要。20世紀(jì)90年代以來(lái)，快速發(fā)展的免疫分析技術(shù)已被應(yīng)用于農(nóng)藥殘留分析和環(huán)境監(jiān)測(cè)，具有簡(jiǎn)便快速、廉價(jià)高效、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

基于常規(guī)抗體(多克隆抗體和單克隆抗體)的三唑磷殘留酶聯(lián)免疫吸附分析方法穩(wěn)定性相對(duì)較低，本發(fā)明以抗三唑磷納米抗體為基礎(chǔ)，采用酶聯(lián)免疫吸附分析方法，其熱穩(wěn)定性均優(yōu)于多克隆抗體免疫分析方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)目前農(nóng)藥殘留儀器分析方法成本高、前處理復(fù)雜、特異性差、靈敏度低和難以實(shí)驗(yàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等不足，提供一種具有高特異性、高靈敏度、高準(zhǔn)確度、高精確度、操作方法簡(jiǎn)單，并能用于大批量樣品快速檢測(cè)的，分析三唑磷殘留的ELISA檢測(cè)試劑盒。適用于水、蔬菜等樣品中三唑磷殘留的快速測(cè)定。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一條用于構(gòu)建駝科動(dòng)物噬菌體展示納米抗體文庫(kù)的C端通用PCR引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

繼而本發(fā)明提供一種抗三唑磷納米抗體，所述抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。例如，將SEQ ID NO:1所示序列去掉末端6個(gè)組氨酸標(biāo)簽后的氨基酸序列。

所述抗三唑磷納米抗體可以按如下方法進(jìn)行制備：利用化學(xué)反應(yīng)合成三唑磷的半抗原O-乙基-O-3-(1-苯基-1,2,4-三唑基)-N-(3-羧甲基)硫代磷酰胺酯，將半抗原與鑰孔血藍(lán)蛋白KLH偶聯(lián)后作為免疫原，免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物駱駝，提取外周血淋巴細(xì)胞的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄及巢式PCR，克隆出納米抗體重鏈(VHH)基因片段，通過(guò)酶切連接，將基因片段克隆至噬菌粒載體，高效電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，經(jīng)輔助噬菌體拯救，構(gòu)建得到噬菌體納米抗體庫(kù)，篩選出特異的三唑磷噬菌體納米抗體，將其表達(dá)純化，得到靈敏度高、特異性強(qiáng)的抗三唑磷納米抗體。制備的納米抗體分子小，可溶性強(qiáng)，耐高溫，易純化，易表達(dá)。