[發明專利]豬NDEL1基因分子標記在肉質檢測中的應用

在審

• 申請號: 201710638758.1
• 申請日: 2017-07-31
• 公開（公告）號: CN107267644A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 馬海明
• 申請（專利權）人: 湖南農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/57
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務所(普通合伙)43008
• 代理人: 江巨鰲

技術領域：

本發明屬于家畜分子生物學技術領域，涉及一種多核苷酸序列中的單核苷酸多態性位點以及檢測所述單核苷酸多態性位點的方法，此方法涉及豬肉質性狀的分子輔助育種。

背景技術：

豬肉是我國城鄉居民動物性蛋白的主要來源，隨著人們對肉品需要量的增加，對肉質的要求也相對提高。而肉質主要是由微效多基因控制，并存在主基因效應。分子生物技術的發展，尤其是近年來基因組測序技術的發展，使得人們可以在DNA水平尋找控制肉質性狀的主基因或與其緊密連鎖的分子標記，并在育種過程中將其應用于標記輔助選擇，以提高選擇進程，更好地改善豬肉質性狀，滿足人們的需要，以獲得更大的經濟效益。

肉質定義最為廣泛接受的是Hoffmarm的定義，即肉質應該考慮感官屬性、營養價值、技術質量和食品安全。感官屬性指外觀(如色澤)、保水力、硬度，食用品質指嫩度、多汁性、風味與滋味、臭味、大理石紋，營養價值指脂肪含量、脂肪酸組成、蛋白質含量、其它營養含量，技術因素指系水力、脂肪硬度、組織分離、氧化穩定性，社會質量指動物福利、環境，食品安全指微生物衛生(無沙門氏菌、彎曲桿菌)、無殘留(抗生素、重金屬、殺蟲劑)。

分子生物技術的發展和豬高密度基因圖譜的構建，使育種工作者可在DNA水平上尋找影響肉質性狀的主基因或與其緊密連鎖的分子標記，理論上這些主基因或分子標記一經確認，就可進行標記輔助選擇育種。

NDEL1基因全名是nudE neurodevelopment protein 1like 1(由Hugo基因命名委員會命名)，編碼一種巰基活性寡肽酶，該酶在細胞周期的M期被磷酸化，而磷酸化調節該蛋白在細胞周期中的分布，在細胞間期，一部分DNEL1蛋白與細胞中心體結合，有絲分裂期進一步結合到紡錘體上。該基因位于人(Homo sapiens)17號染色體p13.1，小鼠(Mus musculus)11號染色體B3，大鼠(Rattus norvegicus)染色體10q24，黃牛(Bos taurus)19號染色體，雞的(Gallus gallus)18號染色體。

但是，目前國內外關于豬NDEL1基因的相關研究沒發現相關報道。該蛋白與細胞周期素依賴蛋白激酶通路互作，可能進一步影響豬肌肉中的肌纖維的運動影響失水率，進一步影響肉的品質。

發明內容：

本發明的目的在于尋找NDEL1基因的突變位點，以及作為豬肉質性狀基因多態性的檢測方法，該方法為肉質性狀輔助育種提供一種有用的分子標記。

為了解決上述問題，本發明所采用的技術方案是：本發明所述的DNEL1基因如SEQ ID NO:1所示的509bp處有一個T/C的堿基突變DNEL1基因的一個C/T的單核苷酸多態性引起，導致PCR-RFLP-Taq I多態性，出現TT型、TC型和CC型。由屠宰率來看，CC型顯著性低于TC型和TT型(P<0.05)，而TT型和TC型之間不存在顯著性差異(P>0.05)。在眼肌面積和失水率方面，TT基因型與CC型和TC型呈顯著性差異(P<0.05),本發明為豬肉質性狀標記輔助選擇提供了新的分子標記。

上述DNEL1基因的多態性是以豬的基因組DNA為模板擴增，擴增片段利用SSCP技術和測序技術發現SNP，并利用PCR－RFLP進行基因分型，再利用SAS軟件通用線性模型(General Linear Model,GLM)分析SNP與肉質性狀的關聯。

本發明制備了檢測SEQ ID NO:1所示的DNEL1基因片段突變的引物對，所述引物序列為：

正向引物為5′-TGGCGATGTCGGGAACCT-3′。

反向引物為5′-CACAGCAACACCCAAGCA-3′。

利用上述引物對進行PCR擴增，PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用限制性內切酶Taq I對PCR產物進行酶切鑒定，最后用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測TT、CC和TC基因型。

利用上述制備的與豬肉質性狀相關的分子標記對外來豬種和中國地方品種進行了關聯分析的應用，從而完成了本發明。

SNP發現與檢測方法建立：申請人設計了擴增包含該SNP引物，NDEL1基因引物擴增的PCR產物經過限制性內切酶Taq I酶切后產生3個不同長度大小的片段，分別為1177bp、509bp、668bp。經過2％瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1所示，只有一條電泳條帶的是TT基因型，大小為1177bp；兩條帶的是CC基因型，大小分別為509bp和668bp；三條帶的是TC基因型，大小分別是509bp、668bp和1177bp。