[發明專利]馬鈴薯A病毒鑒定用的引物、試劑盒及鑒定方法

在審

• 申請號: 201710633014.0
• 申請日: 2017-07-28
• 公開（公告）號: CN108251555A
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發明（設計）人: 陳定虎;單振菊;楊雷亮;王章根
• 申請（專利權）人: 陳定虎
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 中山市興華粵專利代理有限公司 44345
• 代理人: 吳劍鋒

1.一種馬鈴薯A病毒鑒定用的引物，其特征在于包括：

PVA-FIP：

5’-CTTGCATCAAGAGTTTCGGCTT-GATGAACAAATGGATGAAGAAGA-3’

PVA-BIP：5’-CGAAGCACTGCGCAGAAATC-TTGTCCTTCACGGCTACA-3’

PVA-F3：5’-TGGAAAAGTACTCTATCCAGTT-3’

PVA-B3：5’-CTGAATGACAGCAATAACGA-3’

PVA-LB：5’-TGAGTAGGCAGAAAGAGGAGAA-3’。

2.一種馬鈴薯A病毒鑒定用的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括有：

3.根據權利要求2所述馬鈴薯A病毒鑒定用的試劑盒，其特征在于所述的2×反應液緩沖液由以下組分組成：

4.一種馬鈴薯A病毒鑒定方法，其特征在于包括以下步驟：

A、植物組織總DNA提取；

B、LAMP檢測：

采用權利要求2所述的試劑盒配置預反應溶液，在預反應溶液中分別加入待檢測的樣品的DNA 5μL，使總量達到25μL；其中對照組在預反應溶液加入去離子水5μL；陽性對照在預反應溶液中加入帶病毒的DNA 5μL；用移液器吸排液法混合，或者合上蓋子輕擊使溶液充分混合后瞬時離心，混合時避免產生氣泡；將混合物置于反應孔中，于65℃恒溫反應90min，最后80℃下保溫5min以結束反應；

C、LAMP結果判斷

擴增反應結束后，使用紫外線照射裝置，波長240-260nm，350-370nm，從反應試管底部向上進行紫外線照射，佩戴眼鏡等防護用具后從反應試管側面進行觀察，若與陽性對照一樣發出綠色熒光，則判定為陽性即樣品中帶有馬鈴薯A病毒；若與陰性對照一樣未發出綠色熒光，則判定樣品中沒有攜帶馬鈴薯A病毒。

5.根據權利要求4所述的鑒定方法，其特征在于步驟A中植物組織總DNA提取的具體步驟：

a.取0.1g植物組織置于液氮中研磨，時間盡量短，保持研缽中有液氮；

b.轉移樣品到1.5mL Rnase free離心管中，加入1mL的PL裂解液顛倒混勻，65℃條件下進行孵育5min，使核蛋白體分解完全；

c.室溫條件下12000rpm離心10min后，取上清轉入新的RNase free過濾柱中；

d.10000rpm離心45s，收集下濾液于收集管中，進行下一步的操作；

e.收集管中加入1倍體積的70％乙醇，顛倒進行混勻，得到的溶液以及沉淀一起轉移到吸附柱RA中，量太多可分次進行過柱；

f.10000rpm下離心45s，棄掉廢液后，重新將吸附柱放回收集管中；

g.加入500μL去蛋白液RE，12000rpm下離心45s，廢液棄掉；

h.加入700μL漂洗液RW，12000rpm下離心60s，廢液棄掉；

i.加入500μL漂洗液RW，12000rpm下離心60s，廢液棄掉；

j.將吸附柱RA重新放回收集管中，12000rpm離心2min，除去漂洗液，以免抑制下游反應；

k.取出吸附柱RA，取一個新的RNase free離心管中放入，根據所預期基因組和RNA的產量在吸附膜中間部位加50-80μL RNase free water，室溫下放置2min后12000rpm離心1min。