[發(fā)明專利]一種蛋白調(diào)控系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710632585.2
• 申請日: 2017-07-28
• 公開（公告）號: CN107312797B
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 梁興祥;王美玲;郭文中;秦莉;姚永超;陳小平
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州中科藍(lán)華生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發(fā)明涉及一種蛋白調(diào)控系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用，所述蛋白調(diào)控系統(tǒng)中的二氫葉酸還原酶與所要調(diào)控的目的蛋白之間采用剛性連接肽進(jìn)行連接，所述剛性連接肽為(EAAAK)_n或A(EAAAK)_nA，其中n為1?6中的任意整數(shù)，優(yōu)選n為6。本發(fā)明的蛋白調(diào)控系統(tǒng)具有更高的目的蛋白表達(dá)量、更高的調(diào)控比例和更高的調(diào)控幅度，具有很廣闊的應(yīng)用價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種蛋白調(diào)控系統(tǒng)及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及一種采用剛性連接肽連接后優(yōu)化的蛋白調(diào)控系統(tǒng)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

DDD(DHFR degradation domain)調(diào)控系統(tǒng)是一種利用泛素蛋白酶系統(tǒng)對目的蛋白進(jìn)行調(diào)控的調(diào)控系統(tǒng)，它利用大腸桿菌的二氫葉酸還原酶(ecDHFR)與目標(biāo)蛋白融合通過控制穩(wěn)定劑添加與否對目的蛋白進(jìn)行蛋白水平的調(diào)控。

ecDHFR可以被DHFR抑制劑甲氧芐氨嘧啶(TMP)所穩(wěn)定。當(dāng)沒有添加穩(wěn)定劑TMP時，ecDHFR及與其融合的蛋白會被泛素標(biāo)記，然后被蛋白酶體識別并降解，從而實現(xiàn)目的蛋白的不表達(dá)。而當(dāng)添加穩(wěn)定劑TMP時，TMP會與ecDHFR結(jié)合并且穩(wěn)定ecDHFR，從而使ecDHFR及與其融合的蛋白保持穩(wěn)定的狀態(tài)不被泛素化降解，目的蛋白可以正常表達(dá)。TMP與ecDHFR結(jié)合從而穩(wěn)定蛋白不被降解這個狀態(tài)是可逆的，添加TMP可以穩(wěn)定ecDHFR，而撤走TMP會導(dǎo)致ecDHFR及其融合蛋白的降解，從而通過控制TMP的量來控制目的蛋白的表達(dá)水平。

TMP是一種常用并且廉價的人用藥，可以直接在人體上使用。另外TMP對DHFR有很強(qiáng)的穩(wěn)定效果，而TMP對ecDHFR的穩(wěn)定作用比哺乳動物的DHFR更強(qiáng)，所以只需要很小量的TMP就可以穩(wěn)定ecDHFR，所以使用DDD調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)控成本比較低。除此以外，TMP還能夠通過血腦屏障以及胎盤屏障，所以DDD可以用于調(diào)控不同時期，不同范圍的蛋白表達(dá)，具有很廣闊的應(yīng)用空間。綜上所述，DDD調(diào)控系統(tǒng)是一種使用方便，應(yīng)用廣泛的的蛋白調(diào)控系統(tǒng)。但是，目前DDD調(diào)控系統(tǒng)仍然存在缺陷：(1)調(diào)控目的蛋白表達(dá)時表達(dá)量低于去除調(diào)控序列時的蛋白表達(dá)量；(2)調(diào)控蛋白表達(dá)幅度低。

常見的構(gòu)建融合蛋白的方法，一是將兩個功能分子直接相連接，其中的功能分子通常包括蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)的球型結(jié)構(gòu)域以及一些高表達(dá)蛋白序列。另一種方法則是通過連接肽序列將功能分子連接起來。一般而言，有如下因素會影響融合蛋白的生物學(xué)活性：1、融合蛋白之間的空間位置；2、融合蛋白各自的受體結(jié)構(gòu)及相互關(guān)系；3、融合蛋白連接肽的長度，折疊，氨基酸組成，是否糖基化，連接肽與兩段連接的蛋白分子之間的適配性，另外連接肽的柔性和疏水性對不擾亂蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域是十分重要的。

連接肽作為融合蛋白之間連接的紐帶，一般都要求有柔韌性好、親水性強(qiáng)等特點(diǎn)，因此甘氨酸作為分子量小、結(jié)構(gòu)簡單，同時親水性強(qiáng)的氨基酸被運(yùn)用到連接肽設(shè)計中。從1988年(GGGGS)n(n≤6)被發(fā)明開始，它作為一種優(yōu)秀的連接肽被一直使用至今，被廣泛運(yùn)用到多種融合蛋白的構(gòu)建中。因為富含甘氨酸，所以這種結(jié)構(gòu)的連接肽相對柔軟并且彎曲，因此這種連接肽被稱為柔性連接肽。但是這種柔性連接肽也有缺點(diǎn)，因為柔軟，所有連接肽兩端連接的蛋白可以隨意活動，容易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，從而使融合蛋白纏繞容易形成二聚體，同時可能會遮蔽蛋白的活性位點(diǎn)影響蛋白的活性。2001年，Arai等人設(shè)計了一種成α螺旋結(jié)構(gòu)的連接肽(EAAAK)_n(n≤6)，這種連接肽具有的剛性結(jié)構(gòu)可以有效的分割融合的兩個蛋白，使其相互影響達(dá)到最小，其二級結(jié)構(gòu)成α螺旋，不易彎折，保證了功能蛋白間距的相對穩(wěn)定。

不同連接肽的效果不一樣，有的連接肽雖然可以提高DDD調(diào)控系統(tǒng)調(diào)控的目的蛋白的表達(dá)量，但是同時也會提高目的蛋白在不添加穩(wěn)定劑時的本底水平，反而降低了DDD調(diào)控系統(tǒng)的靈敏度，所以需要選擇合適的連接肽連接ecDHFR蛋白以及所要表達(dá)的目的蛋白。

發(fā)明內(nèi)容