[發明專利]檢測胰蛋白酶的生物傳感器及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201710627227.2
• 申請日: 2017-07-28
• 公開（公告）號: CN107543850B
• 公開（公告）日: 2019-12-13
• 發明（設計）人: 苗向陽;朱小力;王兆寅;郁惠珍;王楊;朱志強
• 申請（專利權）人: 蘇州健雄職業技術學院
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N33/68
• 代理公司: 32252 南京鐘山專利代理有限公司
• 代理人: 李小靜

1.一種檢測胰蛋白酶的生物傳感器，其特征在于，包括磁性金電極、磁納米顆粒、多肽鏈1和多肽鏈2，所述磁納米顆粒的表面修飾有羧基，所述多肽鏈2的表面加載有銀納米顆粒，所述多肽鏈1和多肽鏈2的一個末端序列均為VIA，所述多肽鏈1中含有精氨酸殘基；所述磁性金電極的檢測端表面通過磁性吸附所述磁納米顆粒，所述多肽鏈1通過末端的氨基與磁納米顆粒表面修飾的羧基反應固定在磁納米顆粒上，所述多肽鏈2通過末端序列VIA自組裝在多肽鏈1上。

2.根據權利要求1所述的檢測胰蛋白酶的生物傳感器，其特征在于，所述多肽鏈1的序列為GGGAGRGVIA。

3.根據權利要求1或2所述的檢測胰蛋白酶的生物傳感器，其特征在于，所述多肽鏈2的序列為VIAGASLWWSEKL。

4.根據權利要求3所述的檢測胰蛋白酶的生物傳感器，其特征在于，所述磁納米顆粒包括四氧化三鐵磁納米顆粒。

5.一種如權利要求1～4任一項所述的檢測胰蛋白酶的生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

(1)在表面修飾有羧基的磁納米顆粒溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，反應15～60min后，將反應液磁分離，去除上清液，加入用三氟乙醇溶解的多肽鏈1，反應1～5h后，將反應液磁分離，去除上清液，清洗后得到多肽鏈1-磁納米復合材料；

(2)避光條件下，在AgNO₃溶液中加入多肽鏈2，磁力攪拌反應15～60min后，緩慢加入用冰水溶解的NaBH₄，再反應5～30min，得到加載有銀納米顆粒的多肽鏈2溶液；

(3)在磁性金電極的檢測端滴加步驟(1)所得的多肽鏈1-磁納米復合材料，待表面干燥后，浸入到步驟(2)所得的加載有銀納米顆粒的多肽鏈2溶液中進行自組裝反應，得到檢測胰蛋白酶的生物傳感器。

6.根據權利要求5所述的檢測胰蛋白酶的生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中，所述表面修飾有羧基的磁納米顆粒溶液由以下方法制得：

在70～90℃水浴及攪拌條件下，在除氧后的NaOH溶液中逐滴加入含FeSO₄、FeCl₃和HCl的混合溶液，持續除氧和攪拌15～60min后，迅速加入檸檬酸三鈉溶液，并將水浴溫度再升溫5～20℃，持續除氧和攪拌30～90min后，將混合液磁分離，所得沉淀物清洗后用超純水溶解，得到表面修飾有羧基的磁納米顆粒溶液。

7.根據權利要求5所述的檢測胰蛋白酶的生物傳感器的制備方法，其特征在于，在檢測溶解有無目標物胰蛋白酶的緩沖溶液的條件下，磁納米顆粒濃度為2mg/ml，多肽鏈1-磁納米復合材料的濃度為2μm。

8.根據權利要求5所述的檢測胰蛋白酶的生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所述自組裝反應在金屬浴條件下進行，金屬浴溫度為30～40℃，自組裝時間為1～5h。

9.一種如權利要求1～4任一項所述的檢測胰蛋白酶的生物傳感器或權利要求5～8任一項所述的制備方法所制備的檢測胰蛋白酶的生物傳感器在檢測血清中胰蛋白酶中的應用，具體操作方法包括以下步驟：以所述的檢測胰蛋白酶的生物傳感器作為工作電極，飽和甘汞電極作為參比電極，鉑絲電極作為對電極，建立三電極系統，將所述三電極系統與電化學工作站連接，將工作電極的檢測端置于稀釋的含有胰蛋白酶的血清溶液中，反應30～90min后，通過電化學工作站檢測出血清溶液中進行電化學反應時的電流大小，然后根據胰蛋白酶濃度對數值與還原電流變化的線性回歸方程，即可定性或定量地測定血清溶液中的胰蛋白酶；

所述胰蛋白酶濃度與還原電流變化的線性回歸方程為：

P＝5.469-0.712lgC (1)

式(1)中，P為胰蛋白酶檢測時的電流變化值，單位為nA；lgC為血清溶液中胰蛋白酶的濃度值，單位為μM；相關系數為R²＝0.996。

10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，胰蛋白酶檢測線性范圍為1ng/mL～100mg/mL，檢測下線為0.032ng/mL。