[發明專利]內切葡聚糖酶基因及其編碼蛋白

有效

• 申請號: 201710626659.1
• 申請日: 2017-07-28
• 公開（公告）號: CN107217065B
• 公開（公告）日: 2019-09-10
• 發明（設計）人: 林峻
• 申請（專利權）人: 福州大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42
• 代理公司: 福州君誠知識產權代理有限公司 35211
• 代理人: 戴雨君

技術領域

本發明涉及生物基因領域，具體涉及一種內切葡聚糖酶基因及其編碼蛋白。

背景技術

在纖維素酶系中，內切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanohydrolase,EC 3.2.1.4)是主要成分，它包含多種同工酶，可以將可溶性纖維素水解成還原性的寡糖。不同來源、不同類型的內切葡聚糖酶的分子量、等電點、酶學特性及分子結構也會有所區別，在纖維素酶系中，內切葡聚糖酶的這種多型性表現是最為明顯的。內切葡聚糖酶在增加果汁得率、啤酒過濾及原油開采方面起著重要作用，并能增強纖維素質服裝的整體質量，如亮度、平滑度等方面。另外，內切葡聚糖酶是木質纖維素底物粘度快速降低的關鍵酶。

目前，內切葡聚糖酶由于在耐熱和抗凍融等方面存在缺陷，極大地限制了內切葡聚糖酶的應用。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種內切葡聚糖酶基因及其編碼蛋白，該基因編碼的內切葡聚糖酶兼具良好的耐熱性和抗凍融性。

本發明所提供的內切葡聚糖酶基因，其核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發明還提供了上述內切葡聚糖酶基因所編碼的蛋白，其蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

本發明所述內切葡聚糖酶基因，是從福建省福州市閩侯縣收集的一份自然環境的水樣品中，通過宏基因組學技術，用試劑盒提取宏基因組DNA，并直接對提取好的DNA進行PCR擴增得到。

本發明內切葡聚糖酶基因編碼的內切葡聚糖酶兼具良好的耐熱性和抗凍融性，擴展了其應用范圍。

附圖說明

圖1為實施例1步驟1中PCR產物的電泳圖譜。

具體實施方式

以下結合附圖和實施例對本發明做進一步說明。以下未注明具體條件的實驗方法，按照本領域常規實驗條件或者制造廠商所建議的條件。

本發明所述內切葡聚糖酶基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述內切葡聚糖酶基因的編碼蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

本發明所述內切葡聚糖酶基因的來源，是從福建福州閩侯收集的一份自然環境的水樣品中，通過宏基因組學技術，用0.22微米的微孔濾膜，通過過濾，截留其中的各種生物，用試劑盒(Mobio牌，DNA Isolation Kit，14900-50-NF，USA)提取宏基因組DNA，并直接對提取好的宏基因組DNA進行PCR擴增得到。

實施例1

通過分子克隆技術，構建內切葡聚糖酶基因的蛋白表達載體

1、對提取好的宏基因組DNA做PCR擴增(50μl體系)

上游引物序列：ATATGCTCGAGGATCccATGAAGCGCCGCG

下游引物序列：GTTAGCAGCCGGATCCAGCGCCGGGAACACC

PCR體系如下：

PCR程序設定如下：94℃預變性10min；(94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s)，并設置30個循環；最后72℃延伸5min。

PCR產物采用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，結果如圖1所示，圖1左起第一個泳道是marker，第二個泳道是PCR產物，目的條帶位置如圖1所示。

本實施例所得PCR產物使用sanger法測序(ABI 3730xl測序儀雙向測序，測序引物為上述“上游引物”和“下游引物”，由廣州英駿生物公司完成)，得到本發明所述內切葡聚糖酶基因的的核酸序列，如SEQ ID NO.1所示。

2、膠回收

使用Omega公司膠回收試劑盒，貨號D2500-01，對步驟1的PCR產物中的目的條帶，進行割膠回收。膠回收的PCR產物(內切葡聚糖酶基因)作為后續in fusion連接反應的底物，用于連接到表達載體上。

3、線性化表達質粒的制備

質粒載體選擇pET15b，先對載體酶切

在37℃下保溫30min，酶切產物采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用上述omega試劑盒回收酶切產物條帶。膠回收產物濃度為32ng/μl。以上即為制備好的線性化的質粒載體，用于后續的In fusion反應。

4、In-Fusion連接反應

將純化好的PCR產物與質粒表達載體相互連接，構建表達載體。

50℃保溫15min，然后置于冰上。

5、轉化