[發(fā)明專利]一種基于雙標記擴增的血漿循環(huán)甲基化DNA電化學檢測方法及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710626465.1
• 申請日: 2017-07-27
• 公開（公告）號: CN107356642B
• 公開（公告）日: 2019-04-12
• 發(fā)明（設計）人: 趙永席;陳鋒;曹曉文;王旭耀
• 申請（專利權）人: 西安交通大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 王霞

1.一種基于雙標記擴增的血漿循環(huán)甲基化DNA電化學檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)提取待檢測血漿樣品中的DNA，用亞硫酸氫鹽修飾處理；

2)設計甲基化特異性引物，包括用地高辛標記正義鏈引物，用生物素標記反義鏈引物；

3)用步驟2)設計的甲基化特異性引物識別步驟1)中經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾的待檢測血漿樣品中的甲基化DNA；

4)利用Taq聚合酶對經(jīng)步驟3)處理的甲基化DNA及甲基化特異性引物進行識別與擴增，產(chǎn)生具有地高辛和生物素雙標記的雙鏈擴增子；

5)在金電極表面修飾地高辛特異性抗體，雙鏈擴增子中標記有地高辛的一端能夠被金電極表面修飾地高辛特異性抗體特異性識別捕獲；

6)在待檢測血漿樣品中加入測試底物3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺，雙鏈擴增子中標記有生物素的一端能夠被辣根過氧化物酶綴合的抗生物素蛋白捕獲，辣根過氧化物酶與測試底物3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺發(fā)生催化反應產(chǎn)生電化學信號，通過實時監(jiān)測電化學信號變化，確定待檢測血漿樣品中甲基化DNA的含量。

2.根據(jù)權利要求1所述的基于雙標記擴增的血漿循環(huán)甲基化DNA電化學檢測方法，其特征在于，所述正義鏈引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；反義鏈引物的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

3.根據(jù)權利要求1所述的基于雙標記擴增的血漿循環(huán)甲基化DNA電化學檢測方法，其特征在于，步驟4)中，識別和擴增的熱循環(huán)條件為：

92℃ 15s；

64℃ 20s；

72℃ 15s；

共30個循環(huán)。

4.根據(jù)權利要求1或3所述的基于雙標記擴增的血漿循環(huán)甲基化DNA電化學檢測方法，其特征在于，識別和擴增時，正義鏈引物和反義鏈引物的濃度為200nM。

5.根據(jù)權利要求1所述的基于雙標記擴增的血漿循環(huán)甲基化DNA電化學檢測方法，其特征在于，步驟5)中，在金電極表面修飾地高辛特異性抗體的具體操作為：

首先，將金電極浸于11-巰基十一烷酸(MUA)的乙醇溶液中過夜，使得金電極表面包覆上MUA；

然后，依次用乙醇和水沖洗掉多余的MUA；

再次，在包覆有MUA的金電極表面加活化劑MES，室溫靜置處理活化羧基基團；

最后，在活化的金電極表面加地高辛抗體，室溫靜置，制得。

6.根據(jù)權利要求5所述的基于雙標記擴增的血漿循環(huán)甲基化DNA電化學檢測方法，其特征在于，MUA的乙醇溶液的濃度為1mM；活化劑MES的濃度為0.1M；地高辛抗體的用量為200ng。

7.根據(jù)權利要求5所述的一種血漿循環(huán)甲基化DNA電化學檢測方法，其特征在于，室溫靜置時間為30min。

8.一種基于雙標記擴增的血漿循環(huán)甲基化DNA電化學檢測試劑盒，其特征在于，包括：

亞硫酸氫鹽修飾試劑包，用于修飾待檢測血漿樣品中的DNA；

甲基化特異性引物，包括地高辛標記的正義鏈引物和生物素標記的反義鏈引物；

Taq聚合酶及反應預混液，用于制備具有地高辛和生物素雙標記的雙鏈擴增子；

金電極及金電極表面修飾的地高辛抗體，用于捕獲目標核苷酸正義鏈；

與辣根過氧化物酶綴合的抗生物素蛋白，用于捕獲目標核苷酸反義鏈；

辣根過氧化物酶，用于與測試底物3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺發(fā)生催化反應產(chǎn)生電化學信號。

9.根據(jù)權利要求8所述的一種基于雙標記擴增的血漿循環(huán)甲基化DNA電化學檢測試劑盒，其特征在于，目標核苷酸正義鏈的序列如SEQ ID NO.1所示；目標核苷酸反義鏈序列如SEQ ID NO.2所示。