[發明專利]一套大熊貓微衛星位點的三重PCR體系檢測方法

在審

• 申請號: 201710626400.7
• 申請日: 2017-07-27
• 公開（公告）號: CN107190098A
• 公開（公告）日: 2017-09-22
• 發明（設計）人: 朱英;楊海瓊;李裕冬;熊鐵一
• 申請（專利權）人: 四川省自然資源科學研究院;中國大熊貓保護研究中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 成都金英專利代理事務所(普通合伙)51218
• 代理人: 袁英

1.一套大熊貓微衛星位點的三重PCR體系檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

a、DNA樣品提取：采用Axygen血液基因組提取試劑盒對大熊貓血液基因組DNA進行提取；

b、評估引物的擴增產物的大小：從文獻中選擇15對大熊貓微衛星引物，分別為Gpz6，Gpz47，Gpz20，Gpl47，Gpl29，Gpl60，Gpz54，Gpl8，Gpl31，Gpl44，Gpz51，Gpl28，Gpl53，Gpy20，Gpy5，在上述15對引物上游的5’端加入接頭序列5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’，引物合成后，分別對大熊貓DNA進行單重PCR擴增，對擴增后的PCR產物按照150～200bp，200～250bp，250bp以上三個不同區間進行初步分組；

c、引物優化：采用Primer Premier 6.0重新設計引物使得擴增產物長度符合要求，且引物組合需使得三個片段區域各包含5對引物；

d、引物組合評估：利用Primer Premier 6.0進行引物間的評估，選擇兩兩引物之間ΔdG<4.0的引物組合備用；

e、三重PCR體系：對d步驟選擇的三重PCR組合均采用10μL PCR體系；

f、三重PCR擴增條件優化：采用降落PCR程序實施三重PCR；

g、基因分型：取1uLPCR產物在7%的變性聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，激光掃描檢測目的產物。

2.根據權利要求1所述一套大熊貓微衛星位點的三重PCR體系檢測方法，其特征在于，b步驟中擴增體系為：1μL含Mg²⁺的10xBuffer，0.8μL 2.5mM的dNTP，引物的上下游10mmol/L各加0.3μL，0.3μL 1pmol/μL的5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’，0.1μL 5U/μL的rTaq酶，10～20ng基因組DNA，補加滅菌超純水至體系為10μL。

3.根據權利要求1或2所述一套大熊貓微衛星位點的三重PCR體系檢測方法，其特征在于，b步驟中擴增的條件為：95℃總變性5分鐘，95℃變性30秒，退火溫度下退火30秒，72℃延伸30秒，共35個循環，最后72℃總延伸5分鐘。

4.根據權利要求1～3任一項所述一套大熊貓微衛星位點的三重PCR體系檢測方法，其特征在于，e步驟中所述10μL PCR體系為：1μL含Mg²⁺的10xBuffer，0.8μL 2.5mM的dNTP，三對引物的上下游10mmol/L各加0.1μL，0.3μL 1pmol/μL的5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’，0.1μL 5U/μL的rTaq酶，10～20ng基因組DNA，補加滅菌超純水至體系為10μL。

5.根據權利要求1～4任一項所述一套大熊貓微衛星位點的三重PCR體系檢測方法，其特征在于，f步驟中所述降落PCR分為四個階段，第一個階段95℃變性5分鐘；第二個階段，95℃變性30秒，62.5℃退火30秒，72℃延伸30秒，共15個循環；第三個階段，95℃變性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸30秒，共20個循環；第四個階段，72℃延伸5分鐘。

6.根據權利要求5所述一套大熊貓微衛星位點的三重PCR體系檢測方法，其特征在于，所述第二個階段退火溫度每循環一次，減少0.7℃。