[發(fā)明專利]一套大熊貓微衛(wèi)星位點(diǎn)的三重PCR體系檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710626400.7
• 申請(qǐng)日: 2017-07-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107190098A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱英;楊海瓊;李裕冬;熊鐵一
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川省自然資源科學(xué)研究院;中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 成都金英專利代理事務(wù)所(普通合伙)51218
• 代理人: 袁英

1.一套大熊貓微衛(wèi)星位點(diǎn)的三重PCR體系檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

a、DNA樣品提?。翰捎肁xygen血液基因組提取試劑盒對(duì)大熊貓血液基因組DNA進(jìn)行提取；

b、評(píng)估引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小：從文獻(xiàn)中選擇15對(duì)大熊貓微衛(wèi)星引物，分別為Gpz6，Gpz47，Gpz20，Gpl47，Gpl29，Gpl60，Gpz54，Gpl8，Gpl31，Gpl44，Gpz51，Gpl28，Gpl53，Gpy20，Gpy5，在上述15對(duì)引物上游的5’端加入接頭序列5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’，引物合成后，分別對(duì)大熊貓DNA進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物按照150～200bp，200～250bp，250bp以上三個(gè)不同區(qū)間進(jìn)行初步分組；

c、引物優(yōu)化：采用Primer Premier 6.0重新設(shè)計(jì)引物使得擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度符合要求，且引物組合需使得三個(gè)片段區(qū)域各包含5對(duì)引物；

d、引物組合評(píng)估：利用Primer Premier 6.0進(jìn)行引物間的評(píng)估，選擇兩兩引物之間ΔdG<4.0的引物組合備用；

e、三重PCR體系：對(duì)d步驟選擇的三重PCR組合均采用10μL PCR體系；

f、三重PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化：采用降落PCR程序?qū)嵤┤豍CR；

g、基因分型：取1uLPCR產(chǎn)物在7%的變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，激光掃描檢測(cè)目的產(chǎn)物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一套大熊貓微衛(wèi)星位點(diǎn)的三重PCR體系檢測(cè)方法，其特征在于，b步驟中擴(kuò)增體系為：1μL含Mg²⁺的10xBuffer，0.8μL 2.5mM的dNTP，引物的上下游10mmol/L各加0.3μL，0.3μL 1pmol/μL的5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’，0.1μL 5U/μL的rTaq酶，10～20ng基因組DNA，補(bǔ)加滅菌超純水至體系為10μL。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述一套大熊貓微衛(wèi)星位點(diǎn)的三重PCR體系檢測(cè)方法，其特征在于，b步驟中擴(kuò)增的條件為：95℃總變性5分鐘，95℃變性30秒，退火溫度下退火30秒，72℃延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃總延伸5分鐘。

4.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述一套大熊貓微衛(wèi)星位點(diǎn)的三重PCR體系檢測(cè)方法，其特征在于，e步驟中所述10μL PCR體系為：1μL含Mg²⁺的10xBuffer，0.8μL 2.5mM的dNTP，三對(duì)引物的上下游10mmol/L各加0.1μL，0.3μL 1pmol/μL的5’-CACGACGTTGTAAAACGAC-3’，0.1μL 5U/μL的rTaq酶，10～20ng基因組DNA，補(bǔ)加滅菌超純水至體系為10μL。

5.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述一套大熊貓微衛(wèi)星位點(diǎn)的三重PCR體系檢測(cè)方法，其特征在于，f步驟中所述降落PCR分為四個(gè)階段，第一個(gè)階段95℃變性5分鐘；第二個(gè)階段，95℃變性30秒，62.5℃退火30秒，72℃延伸30秒，共15個(gè)循環(huán)；第三個(gè)階段，95℃變性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸30秒，共20個(gè)循環(huán)；第四個(gè)階段，72℃延伸5分鐘。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一套大熊貓微衛(wèi)星位點(diǎn)的三重PCR體系檢測(cè)方法，其特征在于，所述第二個(gè)階段退火溫度每循環(huán)一次，減少0.7℃。