[發明專利]一種山葡萄種質資源的鑒定方法及其應用

有效

• 申請號: 201710621364.5
• 申請日: 2017-07-27
• 公開（公告）號: CN107267640B
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發明（設計）人: 艾軍;李昌禹;宋慧芳;劉海雙;劉迎雪;楊義明;范書田;許培磊;石廣麗;趙瀅
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院特產研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895
• 代理公司: 北京超凡志成知識產權代理事務所(普通合伙) 11371
• 代理人: 許洪潔

本發明涉及分子鑒定技術領域，具體而言，涉及一種山葡萄種質資源的鑒定方法及其應用，所述方法包括以下步驟：擴增待測樣品的psbA?trnH和/或ITS2序列片段并測序；參照不同已知山葡萄種的psbA?trnH和/或ITS2條形碼序列進行序列比對，以確定待測樣品的山葡萄種。本發明提供的山葡萄種質資源的鑒定方法將psbA?trnH序列與ITS2序列相結合，將psbA?trnH序列作為山葡萄種質資源的DNA條形碼序列，同時將ITS2序列作為psbA?trnH序列的補充序列，來提高山葡萄種質資源的鑒別效率，可用于山葡萄的種間和種內資源的鑒定。

技術領域

本發明涉及分子鑒定技術領域，具體而言，涉及一種山葡萄種質資源的鑒定方法及其應用。

背景技術

山葡萄(Vitis amurensis)屬于東亞種群，為葡萄科葡萄屬(Vitis)落葉藤本，是葡萄屬中最抗寒的一個種。枝蔓可耐-45℃低溫，根系可耐-16℃低溫，原產于我國東北、華北及朝鮮北部、前蘇聯遠東地區。野生山葡萄資源在我國長白山和小興安嶺山脈極為豐富，是我國野生果樹馴化栽培最成功的果樹之一。山葡萄漿果營養價值豐富，同時是釀造高檔葡萄酒的優質原料，純種山葡萄也對白粉病、白腐病等有較強的抵抗力，是國內外培育抗寒、抗病、優質新品種的寶貴種質資源及砧木育種資源。目前中國農業科學院特產研究所、吉林省農業科學院果樹研究所、中國農業科學院鄭州果樹研究所、西北農林科技大學等單位保存部分山葡萄種質資源。農業部于1988年出資建立了國家果樹種質左家山葡萄圃，掛靠于中國農業科學院特產研究所，該圃現保存種質資源400余份，主要來自黑龍江、吉林、遼寧和河北等地，其中從黑龍江收集的資源占65％以上，其中包括在世界范圍內首次發現的四倍體山葡萄種質4N1和兩性花山葡萄種質雙慶。該山葡萄圃在世界上保存山葡萄種質份數最多，已成為全國山葡萄生產示范和優良品種推廣的基地及山葡萄種質資源教學、研究、利用的平臺。因此，對山葡萄種質資源進行鑒定研究具有重要的意義。

DNA條形碼(DNA barcoding)是應用一種相對較短、易擴增、有足夠變異的DNA序列來進行物種分類、鑒別的分子生物學技術。該技術由加拿大動物學家Hebert等首次提出，并分析了動物界11個門13320個物種的(cytochrome c oxidase subuit 1)CO1基因序列，發現該序列種間變異能夠對物種進行成功鑒定，自此CO1基因成為動物界中標準的DNA條形碼基因。而在植物中CO1基因進化較慢，雖然各種DNA條形碼在不同植物中都有研究，但并沒有發現能夠鑒別所有物種的標準序列。2009年CBOL(Consortium for the Barcode of Life)通過大量的研究，提出將rbcL+matK序列組合作為植物分子鑒定的核心條形碼，中國植物條形碼研究組應用1757種植物對序列/序列組合psbA-trnH、ITS/ITS2及rbcL+matK進行鑒別能力評價，并提出將ITS/ITS2序列作為種子植物的核心條形碼。Vinitha等對姜科7個屬20個種的60份樣本進行分析，發現ITS序列在測試樣本中的鑒定成功率較高。目前，ITS、ITS2、psbA-trnH、rbcL、matK和rbcL+matK這幾個候選序列/序列組合擴增成功率和物種識別率較高，通用性較好，是植物條形碼研究中重點推薦的候選序列，多數研究都在某一物種的種及以上水平，因此要確定某一植物科、屬、種及品種合適的DNA條形碼序列就要進行深入的研究和篩選。

山葡萄資源豐富，目前資源鑒定都以形態學標記為主，這種方法簡單但易受到季節變化、栽培管理方式、環境因子和主觀判斷因素的影響，致使苗木市場出現同名異物、同物異名的現象，嚴重影響山葡萄產業的發展。對山葡萄種質資源的鑒別是目前研究和資源利用的難題之一。

有鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的目的在于提供一種山葡萄種質資源的鑒定方法，以解決上述問題。

為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：

本發明涉及一種山葡萄種質資源的鑒定方法，包括以下步驟：