[發明專利]一種分離水蛭素發酵液中色素分子的方法

有效

• 申請號: 201710620888.2
• 申請日: 2017-07-27
• 公開（公告）號: CN107353338B
• 公開（公告）日: 2020-11-17
• 發明（設計）人: 朱文瑾;陳平;李浛民
• 申請（專利權）人: 寧波博睿修存生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/815
• 分類號: C07K14/815;C07K1/22;C07K1/20
• 代理公司: 寧波市鄞州盛飛專利代理事務所(特殊普通合伙) 33243
• 代理人: 洪珊珊

本發明涉及一種分離水蛭素發酵液中色素分子的方法，屬于生物醫藥的分離純化。所述方法包括在水蛭素發酵液中加入疏水色譜填料進行吸附，吸附沉淀洗脫后，即得分離色素分子的水蛭素蛋白。整個吸附洗脫過程操作簡單，分離色素的同時還具有一定的純化作用，水蛭素蛋白回收率可達70％。

技術領域

本發明涉及一種分離水蛭素發酵液中色素分子的方法，屬于生物醫藥的分離純化。

背景技術

1884年，人們在醫用水蛭(hirudo meduimalis)中發現有很強的抗凝物質，命名為水蛭素(hirudin Hir)。到1950年以后，從醫用水蛭唾液腺中分離得到具有生物活性的水蛭素。七十年代初確定，水蛭素是凝血酶的特異性抑制劑。八十年代，確定了水蛭素的氨基酸序列，并對其構數關系及其生物學作用機理進行了一系列研究，水蛭素是一個由多種異構體所組成的家族，常見有三種分別為HV-1、HV-2和HV-3，異構體間有高度的同源性，都是由65個氨基酸所組成的單鏈多肽，分子量約為7000Da，氨基酸組成分析表明，水蛭素分子中不含精氨酸和色氨酸，而富含谷氨酸、天門冬氨酸以及谷氨酰胺和天門冬酰胺，比活性約為10000IU/mg蛋白。

由于水蛭素具有重要的醫藥價值，而天然水蛭素來源限制，故國內外醫藥界均著重研究通過基因工程獲得重組水蛭素。基于已知的水蛭素氨基酸序列，在體外合成相應序列DNA片段，插入重組表達載體，在大腸桿菌和酵母細胞中表達。畢赤酵母(pichiapastoris)表達系統是具有分泌優勢的高表達真核系統。其分泌表達量高，酵母工程菌穩定性好，高密度發酵條件下，能大大提高產物的表達水平等。

重組水蛭素的成功構建表達后，需要對重組水蛭素進行分離純化工作，優化的分離純化方法可以使水蛭素純度提高，成本降低。傳統的分離重組水蛭素以去除色素分子多采用兩步法：1、超濾膜濃縮水蛭素；2、低溫乙醇沉淀濃縮后的水蛭素，分離色素分子。現有的分離技術具有以下難點:1、兩步法超濾濃縮--乙醇沉淀后水蛭素活性蛋白回收率在40％左右，蛋白回收率較低；2、因發酵過程中會產生蛋白降解酶，而該降解酶會水解水蛭素活性，因此超濾濃縮時間過長，不利于水蛭素活性的穩定；且超濾膜的消耗較大，濃縮成本高；3、兩步法乙醇使用量大，不利于環保。

發明內容

本發明的目的是針對目前現有分離技術出現的問題，提供一種快速分離水蛭素發酵液中色素分子的方法，使用疏水作用色譜分離提純，提高水蛭素蛋白回收率。

為了達到上述發明目的，本發明采用以下技術方案：

一種分離水蛭素發酵液中色素分子的方法，所述方法包括在水蛭素發酵液中加入疏水色譜填料進行吸附，吸附沉淀洗脫后，即得分離色素分子的水蛭素蛋白。

疏水色譜填料由化學性質穩定、機械強度好的載體和疏水表面基團組成，因而疏水色譜填料的表面具有弱疏水特性。而水蛭素蛋白表面存在一些疏水區域，蛋白質分子中的疏水區域可以與填料表面產生疏水性相互作用而被吸附，而發酵液中色素分子的疏水性要遠遠小于水蛭素蛋白，其與疏水色譜填料吸附性不強，當水蛭素發酵液經疏水色譜填料吸附洗脫時，根據疏水性差異，疏水性低的色素分子先被洗脫出來，水蛭素蛋白隨后被洗脫出來，從而實現色素分子與水蛭素蛋白的分離。且水蛭素蛋白與疏水色譜填料的疏水作用是一種很溫和的相互作用，在洗脫后能保持蛋白分子的結構和活性。

作為優選，所述疏水色譜填料由硅膠基質以及表面鍵合苯甲基基團形成。硅膠表面鍵合苯甲基基團，苯甲基基團的疏水性要大于普通的羥丙基、甲基、丙基等鍵合基團，表面鍵合基團疏水性越大，水蛭素蛋白與之疏水作用越強，吸附洗脫的時間越長，從而更易與色素分子分離，但是硅膠表面鍵合基團的疏水性太強，會導致蛋白質分子不可逆吸附和生物活性損失，因此本發明選擇苯甲基基團作為硅膠表面鍵合基團。