[發(fā)明專利]重組BsaI限制性內(nèi)切酶的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710620686.8
• 申請(qǐng)日: 2017-07-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107267545A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李森;雍德祥;鄒剛剛;王方平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N9/22
• 代理公司: 北京輕創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11212
• 代理人: 沈尚林

1.重組Bsa I限制性內(nèi)切酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)表達(dá)質(zhì)粒pCreat SII-Bsa I的構(gòu)建；

(2)Bsa I蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定；

(3)Bsa I蛋白的純化與鑒定。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述表達(dá)質(zhì)粒pCreat SII-Bsa I的構(gòu)建，具體包括以下步驟：

(4)Bsa I的基因合成

根據(jù)密碼子優(yōu)化后的基因序列，直接進(jìn)行基因合成；

(5)Gibson重組連接

將pCreat SII通過(guò)酶切進(jìn)行線性化，線性化產(chǎn)物與步驟(4)的基因合成產(chǎn)物進(jìn)行無(wú)縫克隆；

(6)重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

將上述重組連接產(chǎn)物20μL轉(zhuǎn)移到TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，冰上靜置30min，42℃熱激90s，冰上再靜置2min；加入600u1LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床200rpm搖45min，涂布于含50ug/mL卡那霉素的LB平板中，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜；

(7)重組克隆的鑒定

隨機(jī)挑取至少4個(gè)克隆，接入4mL含卡那霉素LB中；37℃搖床220rpm搖過(guò)夜，抽提質(zhì)粒并測(cè)序。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)具體包括以下步驟：

(8)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌

將上述鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒pCreat S II-Bsa I轉(zhuǎn)入感受態(tài)BL21(DE3)中，涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜；

(9)IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)

挑單克隆于含卡那霉素LB中，37℃搖床，220rpm培養(yǎng)過(guò)夜，以1∶100接過(guò)夜菌于4mL含卡那霉素LB板中，繼續(xù)培養(yǎng)2.5h，OD600nm達(dá)到0.6～0.8時(shí)加入IPTG至0.5mM，于15℃過(guò)夜誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；

(10)SDS-PAGE鑒定

取2mL菌液12000rpm離心1min收集菌體，加入100μL的1×上樣緩沖液，煮沸5min，冷卻后12000rpm離心1min，取10μL樣品進(jìn)行12％聚丙烯酰胺凝膠電泳，取下凝膠利用快染儀染色脫色10min，觀察誘導(dǎo)前后蛋白條帶的變化，結(jié)果顯示目的蛋白有表達(dá)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)具體包括以下步驟：

(11)Bsa I蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將過(guò)夜培養(yǎng)已轉(zhuǎn)入pCreat S II-Bsa I的BL21(DE3)菌液以1∶100接于800ml含卡那霉素LB中，37℃搖床，220rpm培養(yǎng)2h，OD600nm達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入IPTG至0.5mM，于15℃過(guò)夜誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，8000rpm離心10min，收集菌體，-20℃保存；

(12)細(xì)菌蛋白表達(dá)形式的分析

-20℃凍存菌體按每克濕菌5mL的比例加入細(xì)菌裂解液，超聲破菌，4℃，16000rpm離心15min，沉淀在底部，分別取上清、包涵體做SDS-PAGE，結(jié)果顯示Bsa I蛋白一部分存在于上清中；

(13)Bsa I蛋白的純化

收集菌體加入裂解液重懸，超聲破碎后離心，16000rpm離心15min，將上清液置于干凈的50ml的離心管中加入2ml Ni柱，4℃孵育2h，裂解液洗柱100ml；利用含有20mM咪唑的裂解液洗脫30ml，含有500mM咪唑的裂解液洗脫5ml；以Bsa I儲(chǔ)存液作為流動(dòng)相過(guò)分子篩Superdex 200，根據(jù)紫外吸收值收集含目的蛋白的洗脫液，將目的蛋白液用12％的SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)。