[發明專利]一種FcγRII受體的ELISA檢測方法

在審

• 申請號: 201710616081.1
• 申請日: 2017-07-26
• 公開（公告）號: CN107748258A
• 公開（公告）日: 2018-03-02
• 發明（設計）人: 艾洪新;劉西燕;朱文娟;龍水清
• 申請（專利權）人: 東曜藥業有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司32103
• 代理人: 范晴

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種FcγRII(CD32)受體的ELISA檢測方法。

背景技術

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，是血管內皮細胞特異性的肝素結合生長因子，可在體內誘導血管新生。VEGF由不同腫瘤細胞分泌，也可在發育中的正常細胞及組織中表達，在體內調節血管的通透性，為血管形成過程中的多種細胞提供一個纖維網絡；在體外能促進基質的降解以及內皮細胞的增殖、遷移、運動和血管腔樣結構的形成，并可動員骨髓來源的內皮祖細胞。VEGF是誘導腫瘤血管形成的作用最強、特異性最高的血管生長因子。所以理論上來說，采用不同方法來干預或抑制血管內皮生長因子可以抑制腫瘤的生長。

治療性單克隆抗體已成為一種應對癌癥及自身免疫疾病的重要治療手段。單抗的功效不僅依賴于其抗體結合區域(Fab)，同時其可結晶區域(Fc)也發揮著重要作用。Fab能夠特異地識別腫瘤相關抗原(TAA)，從而調控TAA相關的下游信號通路。IgG分子的Fc區域能發揮一系列生物學功能進一步提升單抗功效。Fc能夠結合FcγRs，FcγRs主要表達在各類免疫白細胞上，當這類細胞被招募和激活，能引發抗體依賴細胞介導的細胞毒作用(ADCC)以及抗體依賴細胞介導的吞噬作用(ADCP)，從而清除目標腫瘤細胞。Fc也能夠結合血清補體分子(C1q)，繼而形成膜攻擊復合物(MAC)清除目的細胞，這一過程被稱為補體依賴的細胞毒作用(CDC)。Fc區域還能夠以PH依賴的方式結合新生的Fc受體(FcRn)，避免抗體被細胞核內體降解，從而延長單抗的半衰期。

在人體中有四類IgG分子的Fc受體：FcγRI(CD64),FcγRII(CD32),FcγRIII(CD16)以及FcRn。其中FcγRI,FcγRIIa,FcγRIIc和FcγRIIIa能夠通過其IMAM激活序列刺激免疫效應細胞激活，從而引發ADCC和ADCP。對應的，FcγRIIb包含一個ITIM抑制序列，從而抑制炎癥反應。FcγRIIb是唯一一個發揮抑制功能的Fc受體。它通常與其它激活性FcγRs表達在相同的細胞上，對于FcγRIIa和FcγRIIIa的信號起到負反饋調節作用，因此FcγRIIb可應用于自身免疫疾病和過敏疾病的治療。此外，FcγRIIb是唯一一個表達在B細胞上的Fc受體，因此抗原特異的B細胞能夠通過FcγRIIb識別自身抗原與治療抗體的復合物，從而發揮免疫抑制作用。所以FcγRIIb能作為體液免疫反應的關鍵檢查點，在紅斑狼瘡(SLE)等疾病中發揮作用。

FcγRII(CD32)基本結構：40kDa穿膜糖蛋白，屬于Ig超家族成員，胞膜外區有2個C2結構，基因染色體定位于1q23～24。FcγRII(CD32)Ⅱ與單體人IgG1，IgG3、IgG4結合為低親合力，Kd5×10-7M。FcγRII(CD32)表達于除紅細胞外的其它血細胞，分子數目：20000～40000/每個細胞。根據DNA序列和功能不同，FcγRII(CD32)可分為三種形式FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIC，不同形式FcγRII的差別主要在于胞漿區的結構不同。GM-CSF對嗜酸性粒細胞的激活作用主要是通過FcγRII介導的。研究FcγRs與IgG的結合對于理解機體免疫及抗體藥物研發具有重要的意義。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對抗VEGF單抗與FcγRIIA(H131)、FcγRIIA(R131)、FcγRIIB受體的的結合能力很弱，用普通的ELISA方法無法形成完整的四參數曲線。本發明創造性的將夾心法ELISA進行擴展，將受體-抗體-二抗的形式發展成受體-免疫復合物-二抗的形式，旨在提高抗體與FcγRIIA(H131)、FcγRIIA(R131)、FcγRIIB的結合活性，提高ELISA檢測方法的靈敏度、穩定性，能夠得到完整的四參數曲線。

為了解決上述技術問題，本發明提供的技術方案為一種用ELISA方法檢測抗VEGF單抗藥物與FcγRII(CD32)結合活性的方法，其包括在酶標板上包被FcγRII-CD32的包被步驟、封閉、樣品配制、二抗孵育、底物顯色的步驟，且所述樣品配制步驟為：抗VEGF單抗與抗原混勻后，靜置一個小時形成免疫復合物。與常規的ELISA方法相比，本方法能得到完整的四參數曲線(呈現完整的上下平臺)，并且具有良好的重復性。

本發明優選的技術方案中，所述FcγRII-CD32選自FcγRIIA(H131)、FcγRIIA(R131)、FcγRIIB中的一種。