[發(fā)明專利]一種FcγRI受體的ELISA檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710616069.0
• 申請(qǐng)日: 2017-07-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107748253A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-03-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱文娟;艾洪新;龍水清;劉西燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東曜藥業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/535
• 分類號(hào): G01N33/535;G01N33/543;G01N33/577;G01N33/68
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司32103
• 代理人: 范晴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種FcγRI(CD64)受體的ELISA檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子，可在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生。VEGF由不同腫瘤細(xì)胞分泌，也可在發(fā)育中的正常細(xì)胞及組織中表達(dá)，在體內(nèi)調(diào)節(jié)血管的通透性，為血管形成過(guò)程中的多種細(xì)胞提供一個(gè)纖維網(wǎng)絡(luò)；在體外能促進(jìn)基質(zhì)的降解以及內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、運(yùn)動(dòng)和血管腔樣結(jié)構(gòu)的形成，并可動(dòng)員骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞。VEGF是誘導(dǎo)腫瘤血管形成的作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生長(zhǎng)因子。所以理論上來(lái)說(shuō)，采用不同方法來(lái)干預(yù)或抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

治療性單克隆抗體被廣泛用于腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病等治療。單抗除具有特異性高、不良反應(yīng)小和作用機(jī)制明確等特點(diǎn)外，半衰期長(zhǎng)也是其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)前的治療性單抗大多為免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)，已成為一種應(yīng)對(duì)癌癥及自身免疫疾病的重要治療手段。單抗的功效不僅依賴于其抗體結(jié)合區(qū)域(Fab)，同時(shí)其可結(jié)晶區(qū)域(Fc)也發(fā)揮著重要作用。Fab能夠特異地識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原(TAA)，從而調(diào)控TAA相關(guān)的下游信號(hào)通路。Fc能夠發(fā)揮一系列效應(yīng)功能如ADCC、ADCP和CDC，進(jìn)一步提升單抗的功效，同時(shí)Fc還能結(jié)合FcRn從而延長(zhǎng)單抗藥品的半衰期。

隨著對(duì)單抗藥效要求不斷提高，選擇合適的IgG亞型以及Fc區(qū)域改造是當(dāng)今單抗研發(fā)的一個(gè)熱點(diǎn)。體內(nèi)許多細(xì)胞表面具有不同類Ig Fc的受體，通過(guò)Fc受體與Ig Fc的結(jié)合，參與Ig介導(dǎo)的生理功能或病理?yè)p傷過(guò)程。目前已鑒定明確屬于CD抗原的Fc受體有FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32a,b,c)、FcγRIII(CD16a,b,c)。

FcγRI(CD64)是大小為70kDa的穿膜糖蛋白，屬Ig超家族成員，胞膜外區(qū)有3個(gè)C2結(jié)構(gòu)，基因染色體定位于1q23～24。識(shí)別CD64的代表性McAb有McAb22、McAb32.2、197和10.1等。FcγRI(CD64)是高親合力受體，Kd值為10-8～10-9M，主要與人的單體IgG1、IgG3以及小鼠IgG2a和IgG3結(jié)合。與人IgG4結(jié)合的親合力明確降低，與IgG2則無(wú)結(jié)合能力。FcγRI(CD64)主要分布于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，但表達(dá)水平各不相同。FcγRI(CD64)位點(diǎn)數(shù)：15000～40000/每個(gè)單核細(xì)胞，>50000/巨噬細(xì)胞，<1000/新鮮中性粒細(xì)胞。IFN-&gamma可刺激單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表達(dá)FcγRI(CD64)水平增加5～10倍，G-CSF也有這種促進(jìn)作用。

近年來(lái)，生物膜干涉技術(shù)(biolayerinterferomeory，BLI)、biacore技術(shù)等被用于FcγRI(CD64)結(jié)合活性的測(cè)定，雖然簡(jiǎn)便快捷，但需要價(jià)格昂貴的大型設(shè)備，不利于普通實(shí)驗(yàn)室、小型生物公司的技術(shù)研發(fā)及產(chǎn)品質(zhì)量的跟蹤監(jiān)測(cè)。而酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)方法，因其操作簡(jiǎn)單、快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、設(shè)備要求簡(jiǎn)單，因此在實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是本發(fā)明創(chuàng)新性的利用夾心ELISA方法檢測(cè)抗VEGF單抗與FcγRI(CD64)受體的的結(jié)合能力，使抗體樣品體外與FcγRI(CD64)受體的結(jié)合活性的檢測(cè)能夠更加簡(jiǎn)單易行。利用本專利檢測(cè)方法能在體外快速、直接檢測(cè)出抗VEGF單抗與FcγRI(CD64)受體結(jié)合活性，且成本較低，實(shí)驗(yàn)操作方便，重復(fù)性好，結(jié)果判斷客觀、靈敏度高。為抗VEGF單抗的一致性評(píng)價(jià)及臨床藥效及藥代動(dòng)力學(xué)研究也提供了參考信息。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為一種用ELISA方法檢測(cè)抗VEGF單抗與FcγRI-CD64受體的結(jié)合活性，即一種FcγRI-CD64受體的ELISA檢測(cè)方法,其包括在酶標(biāo)板上包被FcγRI-CD64的包被步驟、封閉、樣品配制、二抗孵育、底物顯色的步驟，且所述樣品配制步驟為：抗VEGF單抗與抗原混勻后，靜置一個(gè)小時(shí)形成免疫復(fù)合物；。與常規(guī)的ELISA方法相比，本方法為抗VEGF單抗與FcγRI(CD64)結(jié)合活性的評(píng)估提供了一種新的分析方法。

本發(fā)明優(yōu)選的技術(shù)方案中，抗VEGF單抗與抗原的摩爾比在0.1～10:1之間；優(yōu)選地，所述抗VEGF單抗與抗原的摩爾比在0.5～5:1之間，更優(yōu)選地，抗VEGF單抗與抗原的摩爾比在1～3:1之間。