[發明專利]一種FcγRIIIA受體的ELISA檢測方法

在審

• 申請號: 201710616063.3
• 申請日: 2017-07-26
• 公開（公告）號: CN107748262A
• 公開（公告）日: 2018-03-02
• 發明（設計）人: 劉西燕;艾洪新;朱文娟;龍水清
• 申請（專利權）人: 東曜藥業有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/543;G01N33/535
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司32103
• 代理人: 范晴

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種FcγRIIIA(CD16)受體的ELISA檢測方法。

背景技術

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，是血管內皮細胞特異性的肝素結合生長因子，可在體內誘導血管新生。VEGF由不同腫瘤細胞分泌，也可在發育中的正常細胞及組織中表達，在體內調節血管的通透性，為血管形成過程中的多種細胞提供一個纖維網絡；在體外能促進基質的降解以及內皮細胞的增殖、遷移、運動和血管腔樣結構的形成，并可動員骨髓來源的內皮祖細胞。VEGF是誘導腫瘤血管形成的作用最強、特異性最高的血管生長因子。所以理論上來說，采用不同方法來干預或抑制血管內皮生長因子可以抑制腫瘤的生長。

單抗的功效不僅依賴于其抗體結合區域(Fab)，同時其可結晶區域(Fc)也發揮著重要作用。Fab能夠特異地識別腫瘤相關抗原(TAA)，從而調控TAA相關的下游信號通路。Fc能夠發揮一系列效應功能如ADCC、ADCP和CDC，進一步提升單抗的功效，尤其是FcγRIII與藥物的ADCC活性直接相關，ADCC是抗體依賴細胞介導的細胞毒作用，當IgG抗體通過Fab段與靶細胞(病毒感染的細胞及腫瘤細胞)表面抗原決定簇特異性結合后，其Fc段可與有FcγR的殺傷細胞(NK細胞、單核-巨噬細胞、中性粒細胞)等效應細胞結合，觸發效應細胞的殺傷活性，直接殺傷靶細胞(病毒感染的細胞及腫瘤細胞)。

FcγRs主要包括FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)以及FcγRIII(CD16)。在這三種受體類型中，FcγRI與抗體的結合力最強，FcγRII和FcγRIII與抗體的結合力相對較弱。

FcγRIII的結構特征：50～70kDa糖蛋白，屬Ig超家族成員，有2個C2結構，基因染色體位于1q23～24。識別FcγRIII代表性的McAb有HUNK2、Leu11、3G8、Gran1和B73.1等。FcγRIII結合人IgG、IgG3，為低親和力受體。可分為FcγRIIIA和FcγRIIIB兩種異型。①FcγRIIIA，穿膜結構，主要分布于巨噬細胞、NK細胞和嗜酸性粒細胞，巨噬細胞表達高水平，而單核細胞表達水平較低。②FcγRIIIB，通過GPI“錨”在中性粒細胞表面，每個人中性粒細胞表達10萬～20萬血液中可溶性的FcγRIIIB，中性粒細胞激活劑短時間處理后可明顯降低FcγRIIIB的表達水平，可能與通過激活內源性蛋白酶切除GPI連接分子有關。

因此，抗體與Fc受體結合能力檢測技術的創新與改進就顯得尤為重要。近年來，生物膜干涉技術(biolayerinterferomeory，BLI)、biacore技術等被用于Fc受體結合活性的測定，雖然簡便快捷，但需要價格昂貴的大型設備，不利于普通實驗室、小型生物公司的技術研發及產品質量的跟蹤監測。而酶聯免疫吸附測定法(ELISA)方法，因其操作簡單、快速、敏感性高、特異性強、設備要求簡單，因此在實驗室廣泛應用。

發明內容

本發明針對現有技術的抗VEGF單抗與FcγRIIIA受體的的結合能力較弱，用普通的ELISA方法做出的ELISA曲線不穩定。本發明創造性的將夾心法ELISA進行擴展，將受體-抗體-二抗的形式發展成受體-免疫復合物-二抗的形式，旨在提高抗體與FcγRIIIA的結合活性，提高Elisa檢測方法的靈敏度、穩定性，能夠得到完整的四參數曲線。創新性的利用夾心ELISA方法檢測抗VEGF單抗與FcγRIIIA受體的結合能力，使抗體樣品體外與FcγRIIIA受體的結合活性的檢測更加簡單易行。

為了解決上述技術問題，本發明提供的技術方案為一種用ELISA方法檢測抗VEGF單抗與FcγRIIIA受體的結合活性，即一種FcγRIIIA受體的ELISA檢測方法，其包括在酶標板上包被FcγRIIIA受體的包被步驟、封閉、樣品配制、二抗孵育、底物顯色的步驟，且所述樣品配制步驟為：抗VEGF單抗與抗原混勻后，靜置一個小時形成免疫復合物。

本發明優選的技術方案中，抗VEGF單抗與抗原的摩爾比在0.1～10:1之間；優選地，所述抗VEGF單抗與抗原的摩爾比在0.5～5:1之間，更優選地，抗VEGF單抗與抗原的摩爾比在1～3:1之間。

本發明優選的技術方案中，將所述的免疫復合物進行梯度稀釋，加入包被好FcγRIIIA的酶標板上進行孵育。

本發明優選的技術方案中，所述抗VEGF單抗為貝伐珠單抗(Avastin)。