[發明專利]修飾植物基因組的方法和手段

在審

• 申請號: 201710616005.0
• 申請日: 2012-08-14
• 公開（公告）號: CN107287234A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: K·達倫;J·迪特根;S·簡森斯;F·莫伊勒韋特;K·韋特林斯;H·莫澤;T·維爾德;R·海因;U·比克爾斯;L·特落林德爾;G·亨寧格爾
• 申請（專利權）人: 拜爾作物科學公司;拜爾作物科學股份公司;拜耳作物科學有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/53;A01H5/00
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所11247
• 代理人: 柴云峰,黃革生

1.用于在預定位點修飾植物細胞的基因組的方法，其包括以下步驟：

a.在所述預定位點附近或在所述預定位點上誘導雙鏈DNA斷裂，所述雙鏈斷裂由向所述細胞中引入識別所述預定位點附近或所述預定位點上的識別序列的雙鏈DNA斷裂誘導(DSBI)酶來誘導；

b.選擇植物細胞，其中已經修復了所述雙鏈DNA斷裂，導致基因組中在所述預選位點處的修飾，其中所述修飾選自

i.至少一個核苷酸的替換；

ii.至少一個核苷酸的缺失；

iii.至少一個核苷酸的插入；或

iv.i.–iii.的任一組合；

其特征在于所述預定位點緊靠現有的原種事件。

2.權利要求1的方法，其中所述預定位點位于所述原種事件的1cM內。

3.權利要求1或2的方法，其中所述預定位點位于所述原種事件的100kb內。

4.權利要求1-3任一項的方法，其中所述預定位點和/或識別位點位于所述原種事件的側翼序列之一內。

5.權利要求1-4任一項的方法，其中所述原種事件是包含在植物基因組內包含的外源DNA的遺傳基因座，所述外源DNA已經被選擇以符合一個或多個以下標：

a)外源DNA的存在不損害植物的其他所期望的特性，如與農藝學性能或商業價值相關的那些特性；

b)事件的特征在于充分定義的穩定遺傳的分子構型，且為其可開發用于鑒定對照的適當工具；

c)在事件的雜合(或半合子)和純合狀態下，目的基因在一系列的環境條件下以商業可接受水平顯示正確、適當且穩定的空間和時間表型表達，在所述環境條件中攜帶所述事件的植物可能處于正常的農藝學用途。

d)外源DNA與植物基因組中允許容易漸滲入所需商業遺傳背景的位置相關。

6.權利要求1－5任一項的方法，其中所述原種事件選自第78段或表1。

7.權利要求1－6任一項的方法，其中所述DSBI酶是非天然存在的。

8.權利要求1－7任一項的方法，其中所述識別序列包含在SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中。

9.權利要求1－8任一項的方法，其中所述識別序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列。

10.權利要求1-9任何一項的方法，其中所述DSBI酶是單鏈大范圍核酸酶或一對大范圍核酸酶，其識別或一致識別所述預定位點并誘導所述雙鏈斷裂。

11.權利要求10的方法，其中所述大范圍核酸酶或大范圍核酸酶對來自I-CreI，并且其中以下氨基酸存在于大范圍核酸酶單元1中：

a.位置32處的S；

b.位置33處的Y；

c.位置38處的Q；

d.位置80處的Q；

e.位置40處的S；

f.位置42處的T；

g.位置77處的R；

h.位置68處的Y；

i.位置70處的Q；

j.位置75處的H；

k.位置44處的T；

l.位置24處的I；

m.位置26處的Q；

n.位置28處的K；

o.位置30處的N，

并且其中以下氨基酸存在于大范圍核酸酶單元2中：

p.位置70處的S；

q.位置44處的Q；

r.位置24處的K；

s.位置26處的A；

t.位置28處的K；

u.位置30處的N；

v.位置32處的S；

w.位置33處的Y；

x.位置38處的Q；

y.位置80處的Q；

z.位置40處的S；

aa.位置42處的T；

bb.位置77處的Q；

cc.位置68處的Y。

12.權利要求10或11的方法，其中所述大范圍核酸酶或大范圍核酸酶對包含SEQ ID NO.6從氨基酸位置11-165和位置204-360的氨基酸序列。

13.權利要求1-12任一項的方法，其中在步驟b.之前，向所述細胞中遞送修復DNA分子，所述修復DNA分子用作修復所述雙鏈DNA斷裂的模板。