[發明專利]一種通用型磺基轉移酶活性分析方法

有效

• 申請號: 201710613404.1
• 申請日: 2017-07-25
• 公開（公告）號: CN107356577B
• 公開（公告）日: 2020-08-25
• 發明（設計）人: 劉成輝;李婭;張語
• 申請（專利權）人: 陜西師范大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 西安永生專利代理有限責任公司 61201
• 代理人: 高雪霞

本發明公開了一種通用型磺基轉移酶活性分析方法，該方法將3’?磷酸腺苷?5’?磷酰硫酸(PAPS)、磺基轉移酶及磺基轉移酶特異性底物混合發生磺酸化反應，生成3’?磷酸腺苷?5’?磷酸鹽，IMPAD1酶能特異性水解3’?磷酸腺苷?5’?磷酸鹽釋放磷酸根(Pi)，經由與Pi具有高結合能力的金屬離子(Mⁿ⁺)和特定熒光探針(FP)組成的混合體系對Pi進行熒光定量檢測，即可實現磺基轉移酶活性的定量分析。該體系中，Mⁿ⁺與FP的結合將導致體系熒光被有效猝滅，而反應過程產生的Pi將有效掩蔽Mⁿ⁺從而使FP的熒光信號恢復。因此，通過監測體系中熒光信號的變化情況，即可實現磺基轉移酶活性的熒光增強式傳感。該方法普遍適用于所有以PAPS為磺酸基團供體的磺基轉移酶活性的檢測。

技術領域

本發明屬于生物活性分子/蛋白酶檢測技術領域，具體涉及一種通過對磺酸化反應過程副產物3’-磷酸腺苷-5’-磷酸鹽水解產生的磷酸根進行定量檢測，從而實現磺基轉移酶活性分析的熒光分析方法。

背景技術

細胞內蛋白等生物分子的磺酸化修飾過程是一種影響蛋白及各類小分子生物活性的極其重要的修飾機制。生物體內磺酸化過程的發生是在磺基轉移酶催化作用下，磺酸基供體3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸上的磺酸基團被轉移到底物分子上使底物磺酸化，該過程伴隨著3’-磷酸腺苷-5’-磷酸鹽副產物的產生。根據其細胞定位以及對直接底物的選擇性，磺基轉移酶可以分為3個主要的家族：細胞溶質磺基轉移酶、碳水化合物磺基轉移酶和酪氨酸蛋白磺基轉移酶(TPST)。細胞溶質磺基轉移酶，主要參與修飾類固醇和神經遞質類分子，在藥物解毒中發揮重要作用。碳水化合物磺基轉移酶主要催化糖脂類、糖蛋白、蛋白聚糖等具有調節細胞交流功能的生物分子的磺酸化修飾，而多糖的磺酸化影響激素的藥物動力學、生長因子和細胞因子活性以及病毒、細菌的入侵。TPST催化的蛋白質酪氨酸磺酸化更是在許多重要的生理過程中發揮著關鍵的調控作用。

鑒于磺基轉移酶催化的磺酸化反應在細胞內多種重要生命過程中均發揮著至關重要的調控作用，其活性異常與多種疾病的發生密切相關，磺基轉移酶也因而被視為對特定疾病進行藥物干預的理想靶標。因此，快速、準確、靈敏地檢測磺基轉移酶的活性對于其生物功能研究、疾病診斷及靶向藥物開發等方面均具有非常重要的意義。雖然磺酸化修飾的普遍性和重要價值逐漸得到人們的重視，在某些方面其重要性不亞于生物分子的磷酸化修飾調控，但對該領域的研究目前并不夠深入。迄今為止調控蛋白磷酸化過程的蛋白激酶活性檢測技術已經相當成熟，而在調控磺酸化過程的磺基轉移酶活性檢測方法方面的研究卻相對匱乏。因此，建立快速靈敏，操作簡單，通用性好的磺基轉移酶活性分析方法，是相關研究領域的基礎和關鍵。

目前，磺基轉移酶活性分析主要依賴于放射性同位素標記技術，將磺酸基供體3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸進行³⁵S標記，然后將HPLC及凝膠電泳等分離手段與放射性顯影相結合進行磺基轉移酶活性分析。但此方法有許多缺點：操作繁瑣、耗時、存在放射性污染等，最重要的是通用性較差，如凝膠電泳適合TPST等以蛋白或多肽為專屬底物的磺基轉移酶活性分析，但不太適于多糖、小分子等底物磺酸化產物的分離檢測。除放射性標記外，目前也有一些報道采用比色法和熒光法測定磺基轉移酶活性，但這些方法僅限于底物在磺酸化前后吸收光譜或熒光性質有顯著改變。且這些方法中，磺酸化反應過程中副產物3’-磷酸腺苷-5’-磷酸鹽的逐漸累積增加會對磺基轉移酶活性產生明顯抑制作用，對磺基轉移酶活性檢測的準確度造成不可避免的影響。

因此，考慮到磺基轉移酶分析對簡單操作、實用性及通用性等方面的需求，理想的磺基轉移酶活性檢測方法應擺脫對放射性標記技術的依賴，且滿足操作簡單、適用范圍廣等特點。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種操作簡單、通用性強、無需昂貴儀器即可靈敏分析磺基轉移酶活性的非放射性熒光分析方法。

解決上述技術問題所采用的技術方案由下述步驟組成：