[發明專利]一種鼓泡狀引物及其組成的試劑盒和應用

有效

• 申請號: 201710611048.X
• 申請日: 2017-07-25
• 公開（公告）號: CN107365769B
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發明（設計）人: 江媛;魏漢敏;劉鵬娟;黎美燕;程云陽;趙霞;章文蔚;拉多杰·德馬納克
• 申請（專利權）人: 深圳華大智造科技股份有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6886;C40B50/06
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 潘登

1.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括鼓泡狀引物，所述鼓泡狀引物為核酸單鏈結構，所述鼓泡狀引物包括依次相連的四個部分：5p臂、通用序列、分子標簽和3p臂；

所述5p臂在鼓泡狀引物的5’端，且在第一輪PCR反應中，根據堿基互補配對原則與DNA模板序列結合；所述通用序列在第一輪PCR反應中，與模板序列不互補而呈凸起的鼓泡狀，且所述通用序列與第二輪PCR反應中的通用引物的3’端序列至少有一部分相同；所述分子標簽由多個簡并堿基組成；所述3p臂在鼓泡狀引物的3’端，且根據堿基互補配對原則與模板序列結合；

所述試劑盒還包括用于第二輪PCR反應的通用引物，所述通用引物包括正向通用引物和反向通用引物；

其中所述通用引物的正向通用引物和反向通用引物的3’端序列分別與所述的鼓泡狀引物的正向鼓泡狀引物和反向鼓泡狀引物中的通用序列至少部分相同；

所述正向通用引物的核酸序列如SEQ ID NO.147所示；

所述反向通用引物的核酸序列為SEQ ID NO.148-235中的任意一種或至少兩種的組合；

所述鼓泡狀引物的正向引物如SEQ ID NO.3-74所示，所述鼓泡狀引物的反向引物如SEQ ID NO.75-146所示。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，

所述試劑盒還包括PCR擴增試劑，所述PCR擴增試劑包括PCR緩沖液PfuTurbo Cx DNA聚合酶和純水；

其中，所述PCR緩沖液包括10×PfuTurbo Cx緩沖液、dNTPs、二甲基亞砜、甜菜堿和硫酸鎂。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述dNTPs是濃度為0.1mM-25mM的dNTPs混合液；所述甜菜堿是摩爾濃度為1M-4M的甜菜堿溶液；所述二甲基亞砜是質量百分濃度為100％的二甲基亞砜；所述硫酸鎂是摩爾濃度為1mM-1M的硫酸鎂溶液；所述DNA聚合酶為PfuTurbo Cx熱啟動DNA聚合酶。

4.一種如權利要求1-3任一項所述的試劑盒用于制備非小細胞肺癌相關突變熱點基因的檢測試劑盒的應用。

5.一種用于檢測非小細胞肺癌相關突變熱點基因的鼓泡狀引物，其特征在于，所述鼓泡狀引物的正向引物如SEQ ID NO.3-74所示，所述鼓泡狀引物的反向引物如SEQ IDNO.75-146所示。

6.一種文庫的構建方法，其特征在于，采用如權利要求1-3中任一項所述的試劑盒，包括如下步驟：

1)提取樣本核酸；

2)第一輪PCR反應，捕獲目的基因編碼序列：以步驟(1)所述核酸為模板，采用所述鼓泡狀引物進行第一輪PCR反應，獲得第一輪PCR擴增產物；

3)純化：純化步驟2)獲得的第一輪PCR擴增產物；

4)第二輪PCR反應，構建測序文庫：以步驟3)純化后的第一輪PCR擴增產物為模板，采用通用引物進行第二輪PCR反應，獲得測序文庫；

5)純化：純化步驟4)獲得的測序文庫。

7.根據權利要求6所述的構建方法，其特征在于，所述第一輪PCR反應為多重PCR反應。

8.根據權利要求6所述的構建方法，其特征在于，所述第二輪PCR反應為多重PCR反應。

9.根據權利要求6所述的構建方法，其特征在于，步驟1)所述樣本來自于人的外周血、心肌組織、淋巴器官、脾臟、骨髓或肝臟中的任意一種或至少兩種的組合。

10.根據權利要求6所述的構建方法，其特征在于，步驟2)所述第一輪PCR反應中，鼓泡狀引物的終濃度為0.1-5nM。

11.根據權利要求6所述的構建方法，其特征在于，在步驟2)所述第一輪PCR反應中，加入PfuTurbo Cx DNA聚合酶，所述PfuTurbo Cx DNA聚合酶的終濃度為0.01-0.5U。