[發明專利]一種細菌中細胞色素P450酶的制備方法及應用

有效

• 申請號: 201710605712.X
• 申請日: 2017-07-24
• 公開（公告）號: CN107177562B
• 公開（公告）日: 2020-02-18
• 發明（設計）人: 帥京妤;陳慶國;陶玲;趙媛媛;符運拓;何佳寧;王亞超
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C02F3/34;C02F101/38
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 賈森君

1.一種細菌中細胞色素P450酶的制備方法，其特征在于，所述制備方法主要包括以下步驟：

a.冷凍-破碎處理：提供細菌培養液，所述細菌培養液的組成成分為：磺胺嘧啶：1-5mg/L，乙酸鈉：1-3g/L，硝酸鈉：0.1-0.2g/L，氯化銨：0.1-0.2g/L，磷酸氫二鉀：0.05-0.1g/L，酵母浸粉：0.05-0.1g/L，溶劑為海水，將芽孢桿菌B-1接種于所述細菌培養液中，在溫度為20-30℃、鹽度為20-35‰、pH值為7.0-8.5的環境下培養7-16天，得到菌液，將菌液恒溫離心獲得菌體，菌體在-15℃~-20℃的溫度下冷凍4-5h，然后在冰水浴下破碎處理，得到提取液；

b.濃縮透析：將上述提取液經0.22μm濾膜過濾去除破碎后的菌體殘余細胞壁，再經聚乙二醇PEG20000濃縮，并用10mmol/L的磷酸鉀緩沖液透析12-24h得到細胞色素P450酶粗品；

c.純化：用10mmol/L，pH7.2的磷酸緩沖液對DEAE纖維素柱平衡后，將細胞色素P450酶粗品上樣，用20mmol/L，pH7.2的磷酸緩沖液以4.5mL/min的流速洗脫；經聚乙二醇PEG20000濃縮后，用5mmol/L的磷酸緩沖液透析24h，用分子截留量為10000的超濾膜再次濃縮；用5mmol/L，pH7.2的磷酸緩沖液對MonoQ柱平衡后，將首次純化后的細胞色素P450酶粗品上樣，用20mmol/L，pH7.2的磷酸緩沖液以4.5mL/min的流速洗脫；用5mmol/L，pH7.2的磷酸緩沖液透析24h，用分子截留量為10000的超濾膜濃縮，干燥后制得細胞色素P450酶成品。

2.根據權利要求1所述的一種細菌中細胞色素P450酶的制備方法，其特征在于，所述細菌在細菌培養液中的接種量為2-5wt%。

3.根據權利要求1所述的一種細菌中細胞色素P450酶的制備方法，其特征在于，步驟a中所述菌液恒溫離心的溫度為3-8℃。

4.根據權利要求1所述的一種細菌中細胞色素P450酶的制備方法，其特征在于，步驟a中所述的破碎處理采用超聲波破碎儀，所述超聲波破碎儀的功率為1000-1200W，溫度為10-20℃，頻率為20-25KHz，10s/10s，時間為15-25min。

5.一種如權利要求1-4任一所述細菌中細胞色素P450酶的制備方法制成的細胞色素P450酶的應用，其特征在于，所述細胞色素P450酶用于降解磺胺類抗生素。

6.根據權利要求5所述的細胞色素P450酶的應用，其特征在于，所述磺胺類抗生素與細胞色素P450酶的質量比為（100-300）：1。