[發明專利]一種植物DNA的簡便、快速提取方法

在審

• 申請號: 201710605160.2
• 申請日: 2017-07-24
• 公開（公告）號: CN107201363A
• 公開（公告）日: 2017-09-26
• 發明（設計）人: 何華綱;紀耀勇;李淑梅;朱姍穎;別同德
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明公布了一種植物DNA的簡便、快速提取方法，屬于分子生物學領域。本發明極大地簡化了植物DNA提取方法，該方法簡便、快速、穩定性好，可廣泛應用于提取分子鑒定所需的各種植物葉片DNA。

背景技術

隨著水稻、玉米、小麥等主要農作物全基因組測序的完成，這些經濟作物的分子標記開發難度明顯下降，利用分子標記進行輔助育種、品種鑒定開始被應用到實際生產之中。但分子鑒定和表觀鑒定不同，必須通過DNA提取和鑒定等一系列程序，故而進行大樣本篩選時，工作量極大，急需適應高通量篩選要求的方法體系，而這其中最需要優化的就是DNA的提取過程。現有DNA提取方法十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法(Doyle et al.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of frexh leaf tissue.Phytochem Bull.1987,19:11-15.)，需經過研磨、裂解、氯仿抽提、離心、沉淀和清洗等步驟，整個流程需要兩小時，可同時操作二十個樣品，平均耗時約六分鐘，需要用去污劑CTAB、有毒有害的有機溶劑氯仿及大量的乙醇，其間需將樣品轉管三次，提取效率低，而且對操作的專業程度、細心程度要求較高，不適合高通量操作；現在應用于高通量DNA提取的DNA提取工作站(余婧等.自動化工作站批量提取烤后煙葉DNA方法的建立與應用.貴州農業科學.2015,5:217-219.)，雖然簡單便捷，但是需要昂貴的設備、專用試劑，對實驗人員的操作要求也比較高；而直接PCR法(Rogers et al.Direct PCR amplification from leaf discs.Plant Sci.1999,143:183-186.)雖然可以省去DNA提取的步驟，但是材料用量對實驗結果有顯著影響，穩定性難以保證，需要使用擴增效果更好也更加昂貴的酶以及PCR增強試劑，而且每次取樣僅能用于一次PCR擴增。所以急需開發一種操作簡單方便，穩定性好，不需要特殊設備儀器，也不需使用有毒有害或者昂貴試劑，可大批量同時處理的新DNA提取方法。

本發明公布了一種植物DNA的簡便提取方法，使用三羥甲基氨基甲烷(Tris)為DNA樣品提供良好的緩沖條件，保證DNA的穩定性；使用乙二胺四乙酸(EDTA)抑制DNA酶活性，防止細胞破碎后細胞中的DNA酶對DNA進行降解；高溫加熱，不僅能裂解植物細胞，釋放DNA，還能滅活植物細胞釋放的各種酶類和附著在植物樣品上的微生物；高速離心能夠去除非水溶性的細胞碎片等雜質。由于提取物中所添加的較高濃度的EDTA會抑制Taq DNA聚合酶的活性，所以在后續的PCR過程中需要增加相應濃度的鎂離子，以中和過多的EDTA，保證PCR正常進行。操作周期約20分鐘，批量處理時可達到每人每分鐘處理一個樣品。只需要EDTA和Tris，后續擴增只需要使用普通的Taq DNA聚合酶。提取每一個樣品，試劑成本不到0.01元人民幣，而且一次提取可用于多次PCR擴增。其間不需要轉管等操作，減少了人為失誤。不需要特殊的儀器設備，沒有太多的操作要求，這將極大的節約人力和材料成本。本發明在遺傳作圖、分子標記輔助育種、品種純度檢測、品種的真實性鑒定等領域具有重要的應用價值。

發明內容

本發明的目的在于公布一種植物葉片基因組DNA提取方法，所述的DNA提取方法可滿足分子標記篩選的DNA模板需要，且省時、操作容易、設備要求低、成本低、安全無毒無污染。

技術方案：

一種植物DNA的簡便、快速提取方法，按照下述步驟進行：

(1)剪取1～2cm²植物葉片置于離心管中，用研磨棒快速研磨得到勻漿；

(2)向所述植物勻漿中加入提取液，70～90℃加熱10～15分鐘，再經過10000～13000r/min離心1分鐘，即得到可直接用于PCR的DNA提取物。

所述提取液由Tris溶液和EDTA溶液組成，其中Tris和EDTA的含量分別為20～50mM和13～25mM，pH 8.0。

所述Tris溶液配制方法如下：0.5M Tris-HCl(200ml)：稱取60.55g Tris，溶于100ml蒸餾水中，再用濃鹽酸調至pH 8.0，定容至200ml，高溫蒸汽滅菌(121℃，20分鐘)。低溫(4℃)儲存。