[發明專利]一種基因編輯系統及應用其對植物基因組進行編輯的方法

有效

• 申請號: 201710599030.2
• 申請日: 2017-07-21
• 公開（公告）號: CN107338265B
• 公開（公告）日: 2020-02-18
• 發明（設計）人: 韓方普;馮超;王銳;柏晗;袁靜;張晶;蘇漢東;劉亞林;郭憲瑞
• 申請（專利權）人: 中國科學院遺傳與發育生物學研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66;C12N9/22;A01H5/00;C12N1/21;A01H6/46
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 任巖

1.一種基因編輯系統，其包括sgRNA轉錄單元，以及由順次連接的來源于玉米的DMC1基因啟動子和Cas9基因組成的DMC1p-Cas9轉錄單元，其中，sgRNA識別的靶位點符合5’-Nx-NGG-3’或者5’-CCN-Nx-3’序列規則，N代表A、T、C和G中的任何一種，14≤X≤30，且X為整數，N_X表示X個連續的脫氧核糖核苷酸。

2.根據權利要求1所述的基因編輯系統，其中，所述DMC1基因啟動子的序列如SEQ IDNO.1所示。

3.一種包括如權利要求1或2所述的基因編輯系統的重組載體。

4.權利要求3所述重組載體的構建方法，其包括如下步驟：

(1)克隆獲得DMC1基因啟動子并將其與Cas9基因順次連接，組成DMC1p-Cas9轉錄單元；

(2)構建識別靶位點的sgRNA轉錄單元，并將DMC1p-Cas9轉錄單元和sgRNA轉錄單元同時導入雙元載體，得到重組載體，其中，sgRNA識別的靶位點符合5’-Nx-NGG-3’或者5’-CCN-Nx-3’序列規則，N代表A、T、C和G中的任何一種，14≤X≤30，且X為整數，N_X表示X個連續的脫氧核糖核苷酸。

5.根據權利要求4所述的構建方法，步驟(1)中，所述DMC1基因啟動子的序列如SEQ IDNO.1所示。

6.根據權利要求5所述的構建方法，步驟(1)中，克隆獲得DMC1基因啟動子采用如下方法：以玉米B73的基因組DNA為模板，以序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物為擴增引物對模板進行PCR反應，擴增得到序列如SEQ ID NO.1所示的片段，即為DMC1基因啟動子。

7.根據權利要求4所述的構建方法，步驟(1)中，在克隆獲得DMC1基因啟動子之后，所述將其與Cas9基因順次連接采用如下方法：將得到的DMC1基因啟動子替換35S-Cas9-SK載體中的35S啟動子，得到pDMC1-Cas9-SK重組載體，再利用Xma I和EcoR I兩個酶切位點將DMC1p-Cas9轉錄單元轉移到雙元載體pTF101.1，得到重組載體pDMC1-Cas9。

8.根據權利要求7所述的構建方法，步驟(2)采用如下操作：將符合5’-Nx-NGG-3’或者5’-CCN-Nx-3’序列規則的靶位點的DNA序列通過引物退火連入pU3-sgRNA載體中，然后通過Hind III酶切位點將sgRNA的轉錄單元亞克隆到重組載體pDMC1-Cas9中，得到包括sgRNA轉錄單元，以及由順次連接的來源于玉米的DMC1基因啟動子和Cas9基因組成的DMC1p-Cas9轉錄單元的重組載體。

9.一種包括權利要求3所述重組載體的基因工程菌。

10.一種應用權利要求1所述的基因編輯系統對植物基因組進行編輯的方法，其包括：將權利要求9所述的基因工程菌轉化受體植物組織，獲得被編輯的轉基因植物材料。

11.根據權利要求10所述的方法，其中，所述植物為單子葉植物。

12.根據權利要求11所述的方法，其中，所述植物為玉米或小麥。

13.根據權利要求10-12中任一項所述的方法，其中，所述受體植物組織為未成熟的幼胚。