[發(fā)明專利]利用pspG基因缺失菌株通過發(fā)酵生產(chǎn)L?氨基酸的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710598635.X
• 申請(qǐng)日: 2017-07-21
• 公開（公告）號(hào): CN107267567A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫會(huì)剛;李同祥;崔玨;張傳麗;高兆建
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 徐州工程學(xué)院
• 主分類號(hào): C12P13/04
• 分類號(hào): C12P13/04;C12P13/08;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 南京瑞弘專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙)32249
• 代理人: 陳國(guó)強(qiáng)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種通過發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法。

背景技術(shù)

在工業(yè)上，目前L-氨基酸的生產(chǎn)方法主要為生物發(fā)酵法，即通過具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的各種微生物的發(fā)酵來生產(chǎn)L-氨基酸，因此具有L-氨基酸生產(chǎn)能力菌株的獲得是L氨基酸生產(chǎn)方法的核心。目前獲得L氨基酸生產(chǎn)菌株的方法主要有兩種，一種是通過對(duì)野生型微生物(野生型菌株)進(jìn)行誘變的方法，使其具有營(yíng)養(yǎng)缺陷，并使其對(duì)某些代謝物產(chǎn)生拮抗作用，從而獲得優(yōu)良的工業(yè)生產(chǎn)菌株。

近年來隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，重組DNA技術(shù)已經(jīng)開始普遍應(yīng)用于微生物代謝工程改造方面，使其成為另外一種重要的獲得L-氨基酸生產(chǎn)菌株的方法。比如，通過提高目標(biāo)產(chǎn)品合成途徑中關(guān)鍵酶的表達(dá)，來達(dá)到提高微生物L(fēng)-氨基酸生產(chǎn)能力(CN1305002A)；再比如，通過提高目標(biāo)產(chǎn)品的分泌蛋白的表達(dá)，來達(dá)到提高微生物L(fēng)-氨基酸生產(chǎn)能力(CN1260393A)；或者，通過降低某些基因的表達(dá)，來達(dá)到提高微生物L(fēng)-氨基酸生產(chǎn)能力(CN1607246A)；在或者，通過敲除某些基因，使其失活，來達(dá)到提高微生物L(fēng)-氨基酸生產(chǎn)能力(CN1466630A)。

pspG的表達(dá)產(chǎn)物是一個(gè)內(nèi)膜蛋白，表達(dá)受到西格瑪(54)-RNA聚合酶的調(diào)控，并受到噬菌體休克蛋白PspF的激活作用和噬菌體休克蛋白PspA的抑制作用。相關(guān)研究表明其過表達(dá)會(huì)造成細(xì)胞的移動(dòng)性能變慢。目前，對(duì)于其對(duì)于L氨基酸合成是否有影響還沒有相關(guān)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種利用pspG基因缺失菌株通過發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法，以提高L-氨基酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種利用pspG基因缺失菌株通過發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法，通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于腸桿菌科，并具有L-氨基酸生產(chǎn)能力的細(xì)菌，該細(xì)菌于培養(yǎng)前進(jìn)行了修飾，使得pspG基因缺失，并從細(xì)菌的培養(yǎng)基或細(xì)胞收集L-氨基酸，來生產(chǎn)L-氨基酸。

進(jìn)一步的，采用pspG基因缺失的菌株ATCC21151ΔpspG，通過發(fā)酵的方法生產(chǎn)得到L-蘇氨酸。

所述pspG基因缺失的菌株ATCC21151ΔpspG通過下述方法構(gòu)建得到：

首先，制備菌株ATCC21151的感受態(tài)細(xì)胞；利用質(zhì)粒pKD46進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得ATCC21151/pKD46菌株；然后，利用基因片段pspGknock1轉(zhuǎn)化ATCC21151/pKD46菌株的感受態(tài)細(xì)胞，獲得的轉(zhuǎn)化子利用引物pspG1-F/pspG1-R進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的菌株命名為ATCC21151ΔpspG::SacBCm；最后，利用基因片段pspGknock2轉(zhuǎn)化ATCC21151ΔpspG::SacBCm菌株的感受態(tài)細(xì)胞，獲得的轉(zhuǎn)化子利用引物pspG2-F/pspG2-R進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的菌株命名為ATCC21151ΔpspG，至此L-蘇氨酸生產(chǎn)所用的pspG基因缺失的菌株ATCC21151ΔpspG構(gòu)建完畢。

進(jìn)一步的，采用pspG基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔpspG，通過發(fā)酵的方法生產(chǎn)得到L-賴氨酸。

所述pspG基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔpspG通過下述方法構(gòu)建得到：

首先，制備菌株ATCC21151的感受態(tài)細(xì)胞；利用質(zhì)粒pKD46進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株；然后，利用基因片段pspGknock2轉(zhuǎn)化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*(pKD46)菌株的感受態(tài)細(xì)胞，獲得的轉(zhuǎn)化子利用引物pspG2-F/pspG2-R進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的菌株命名為MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔpspG::SacBCm；最后，利用基因片段pspGknock2轉(zhuǎn)化MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔpspG::SacBCm菌株的感受態(tài)細(xì)胞，獲得的轉(zhuǎn)化子利用引物pspG2-F/pspG2-R進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的菌株命名為MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔpspG，至此L-賴氨酸生產(chǎn)所用的pspG基因缺失的菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*ΔpspG構(gòu)建完畢。

所述菌株MG1655/pwsk-lysC*-dapA*通過下述方法構(gòu)建得到：

利用多片段重組的方法構(gòu)建以低拷貝質(zhì)粒pWSK29為出發(fā)載體，包含dapA基因表達(dá)框和lysC基因表達(dá)框的質(zhì)粒pwsk-lysC-dapA；