[發(fā)明專利]一種從大規(guī)模鰭藻培養(yǎng)藻液中制備扇貝毒素-2標準樣品的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710598625.6
• 申請日: 2017-07-21
• 公開（公告）號: CN107941968B
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發(fā)明（設計）人: 佟蒙蒙;譚志軍;王玉;彭吉星;吳海燕;郭萌萌;付樹林;翟毓秀;高寒
• 申請（專利權）人: 浙江大學;中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/02
• 代理公司: 北京知企鴻蒙專利代理事務所(普通合伙) 11692
• 代理人: 劉帥帥

本發(fā)明公開了一種從大規(guī)模鰭藻培養(yǎng)藻液中制備扇貝毒素?2標準樣品的方法，包括下列步驟：1）大規(guī)模培養(yǎng)藻液破碎；2）毒素提取；3）葡聚糖凝膠色譜柱分離；4）扇貝毒素?2高效液相色譜分離；5）扇貝毒素?2高效液相色譜純化；6）檢驗所述標準樣品的均勻性和穩(wěn)定性。本發(fā)明采用高效液相色譜法制備扇貝毒素?2，前處理簡單快捷，易于操作；收集方法簡單；制備的標準樣品均勻穩(wěn)定，且純度達90%以上。

技術領域

本發(fā)明涉及一種貝類毒素標準樣品及其制備方法，具體的說，涉及一種從鰭藻培養(yǎng)藻液中制備扇貝毒素-2標準樣品的方法，屬于生物技術領域。

背景技術

扇貝毒素(Pectenotoxins,PTXs)是一類聚醚類大環(huán)內(nèi)酯結構的脂溶性化合物，呈現(xiàn)7個小環(huán)醚結成的環(huán)狀結構，在2004年柏林召開的海洋生物毒素會議上，F(xiàn)AO/IOC/WHO將其列為八大類海洋生物毒素中的一類。扇貝毒素-2(PTX2)是扇貝毒素類中最常見的的一種，化學式為C₄₇H₇₀O₁₄，分子質(zhì)量為859.07，[M+NH₄]⁺：m/z?876.5104。扇貝毒素-2主要由海洋甲藻中的鰭藻(Dinophysis?spp.)產(chǎn)生，如鰭藻Dinophysis?acuta，D.fortii，D.acuminata，D.caudata，D.norvegica，D.rotundata和D.infundibulus等，于1984年首次從日本的養(yǎng)殖扇貝Patinopecten?yessoensis中鑒定發(fā)現(xiàn)，后在全球各地的貝肉和海水中廣泛檢出。研究發(fā)現(xiàn)這種毒素可導致小鼠腹腔注射高致死率，此外有研究發(fā)現(xiàn)其對幾株人類肺癌細胞的具有潛在細胞毒性。因此，歐盟規(guī)定各種水產(chǎn)品的可食用組織中OA，DTXs和PTXs的含量總和不能超過160μg/kg，但包括中國在內(nèi)的許多國家和地區(qū)尚沒有專門針對PTXs毒素的檢測規(guī)范和食用安全標準。

目前尚未發(fā)現(xiàn)扇貝毒素-2的標準制備技術的報道，我國缺乏扇貝毒素的組分結構、分布規(guī)律的背景研究資料，國內(nèi)檢測海洋生物毒素的標準樣品主要依賴從國外進口，其中加拿大國家研究委員會(NRC)下屬的海洋生物科學研究所(IBM)提供的扇貝毒素的標準物質(zhì)，已被包括我國在內(nèi)的40多個國家的海產(chǎn)品和水質(zhì)實驗室采用。此外美國SIGMA公司也成功建立腹瀉性貝類毒素OA的標準品制備工序。購買國外標準毒素價格昂貴且含量很少，但是國內(nèi)的快速檢測試劑開發(fā)需要大量標準品。總的來說，我國在海洋生物毒素標準品的研制方面鮮見報道，僅見有麻痹性海洋生物毒素標準樣品制備專利1項。因此，為加強和建立我國貝毒流行病學管理系統(tǒng)、有效地預防和控制我國貝毒事件的發(fā)生，急需海洋生物毒素的標準物質(zhì)制備技術。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對當前市售扇貝毒素標準品的不足，所要解決的技術問題是：提供一種從大規(guī)模培養(yǎng)藻液中提取、分離純化扇貝毒素-2的簡單快捷，易于操作的高效液相制備技術方法。

本發(fā)明還提供一種應用本方法制備的扇貝毒素-2的標準樣品。

本發(fā)明還提供該扇貝毒素-2標準樣品的應用。

為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是：

本發(fā)明提供的大規(guī)模鰭藻培養(yǎng)藻液中扇貝毒素-2標準品的液相制備方法，采用如下技術方案：

1)大規(guī)模培養(yǎng)藻液破碎：

取前期培養(yǎng)的中國株鰭藻Dinophysis?acuminata(DAYS01-E6,F2)的大規(guī)模培養(yǎng)液，過10～15μm濾膜后于-196℃左右液氮下冷凍。待冷凍完全后，再將其置于室溫下解凍。待解凍完全再反復進行2次凍融。取室溫解凍完全的藻液，置于冰水中，在冰浴條件下，使用超聲波細胞破碎機進行細胞破碎。超聲波細胞粉碎機的實驗條件為：超聲功率200～325W、超聲頻率為10～25kHz、總工作時間15～20min，超聲波處理時樣品溫度15～30℃，儀器連續(xù)工作時間90～150min。