[發(fā)明專利]一種建立蜂王漿致敏蛋白的液質(zhì)聯(lián)用分析的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710598214.7
• 申請(qǐng)日: 2017-07-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107290461B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張虹;林娜;陳思
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江工商大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N30/06
• 分類(lèi)號(hào): G01N30/06;G01N30/88
• 代理公司: 南京禹為知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 32272
• 代理人: 王曉東

本發(fā)明公開(kāi)了一種建立蜂王漿致敏蛋白的液質(zhì)聯(lián)用分析的方法，包括，電泳分析蜂王漿蛋白，對(duì)致敏蛋白條帶預(yù)處理，液質(zhì)聯(lián)用方法分析鑒定，篩選致敏蛋白特異肽段；對(duì)蜂王漿樣品進(jìn)行蛋白提取、酶法消化，LC?MS/MS法致敏蛋白定量測(cè)定。我方發(fā)明的針對(duì)致敏蛋白定量方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、線性范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，可以有效地對(duì)實(shí)際樣品中某種致敏蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種建立蜂王漿致敏蛋白的液質(zhì)聯(lián)用分析的方法。

背景技術(shù)

蜂王漿簡(jiǎn)稱RJ，又名蜂皇漿、蜂皇乳、蜂王乳、蜂乳，是蜜蜂巢中培育幼蟲(chóng)的青年工蜂咽頭腺的分泌物，是供給將要變成蜂王的幼蟲(chóng)的食物，也是蜂王終身的食物。

所謂蜂王漿就是青壯年蜜蜂食用花粉后分泌的一種乳狀物，此乳狀物就像哺乳動(dòng)物的乳汁并且極具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和免疫功能而且含有極高的長(zhǎng)壽因子，蜜蜂(工蜂或雄峰)和蜂王在卵期是一樣的，孵化后吃三天蜂王漿以后改為吃蜂蜜和花粉的長(zhǎng)成蜜蜂，孵化后一直食用蜂王漿的長(zhǎng)成蜂王，蜜蜂(工蜂或雄峰)的壽限在一至六個(gè)月而蜂王因一直食用蜂王漿一般能活五到七年。蜂王漿的顏色是根據(jù)蜜蜂食用花粉的不同而稍有改變一般分為乳白色和微黃色。

蜂王漿中干物質(zhì)中約50％為蛋白質(zhì)，其中MRJP1(Major Royal Jelly Protein1)含量最豐富，約占蜂王漿水溶性蛋白的48％。MRJP1以3種形式存在：?jiǎn)误w、低聚體以及與脂肪酸相互作用后形成的水不溶性聚合體。

Nano-RPLC為納升反相液相色譜。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于蜂王漿中MRJP1的定量分析多采用ELISA技術(shù)，其檢測(cè)限高、線性范圍差，難以大規(guī)模推廣。

發(fā)明內(nèi)容

本部分的目的在于概述本發(fā)明的實(shí)施例的一些方面以及簡(jiǎn)要介紹一些較佳實(shí)施例。在本部分以及本申請(qǐng)的說(shuō)明書(shū)摘要和發(fā)明名稱中可能會(huì)做些簡(jiǎn)化或省略以避免使本部分、說(shuō)明書(shū)摘要和發(fā)明名稱的目的模糊，而這種簡(jiǎn)化或省略不能用于限制本發(fā)明的范圍。

鑒于上述和/或現(xiàn)有建立蜂王漿致敏蛋白的液質(zhì)聯(lián)用分析的方法的技術(shù)空白，提出了本發(fā)明。

因此，本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種建立蜂王漿致敏蛋白的液質(zhì)聯(lián)用分析的方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：一種建立蜂王漿致敏蛋白的液質(zhì)聯(lián)用分析的方法，包括，電泳分析蜂王漿蛋白，對(duì)致敏蛋白條帶預(yù)處理，液質(zhì)聯(lián)用方法分析鑒定，篩選致敏蛋白特異肽段；對(duì)蜂王漿樣品進(jìn)行蛋白提取、酶法消化，LC-MS/MS法致敏蛋白定量測(cè)定。

作為本發(fā)明所述建立蜂王漿致敏蛋白的液質(zhì)聯(lián)用分析的方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述用LC-MS/MS進(jìn)行致敏蛋白定量測(cè)定，還包括，對(duì)蜂王漿樣品的目標(biāo)肽段的二級(jí)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)與所述篩選致敏蛋白特異肽段進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)，觀察目標(biāo)肽段的二級(jí)斷裂碎片及其信號(hào)強(qiáng)度是否完全匹配，以證明實(shí)驗(yàn)中篩選出的特異肽段是否符合要求。

作為本發(fā)明所述建立蜂王漿致敏蛋白的液質(zhì)聯(lián)用分析的方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述對(duì)蜂王漿樣品進(jìn)行蛋白提取、酶法消化，其是，將蜂王漿樣品與水按質(zhì)量比4:4～6混合，0～5℃抽提過(guò)夜提取，隨后在離心力10000～14000g下離心20～40min，取上清液用NH₄HCO₃稀釋，加入二硫蘇糖醇，50～60℃水浴加熱20～40min；冷卻后加入碘乙酰胺，避光室溫下反應(yīng)20～40min，加入胰蛋白酶，混勻后35～40℃下水浴過(guò)夜，再加入甲酸，所得消化液用初始流動(dòng)相稀釋，然后在離心力10000～14000g，0～4℃下離心20～40min，過(guò)濾膜待用。

作為本發(fā)明所述建立蜂王漿致敏蛋白的液質(zhì)聯(lián)用分析的方法的一種優(yōu)選方案，其中：所述初始流動(dòng)相，包括乙腈與水按體積比1:8～10混合液和0.1～0.2％的甲酸。