[發明專利]特異性抑制COL12A1基因表達的siRNA及其重組載體和應用

有效

• 申請號: 201710597972.7
• 申請日: 2017-07-20
• 公開（公告）號: CN107541514B
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發明（設計）人: 陳懷增;葉楓;劉佳;洪蝶;王浛知;程琪;余明華;周彩云
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;A61K31/713;A61P35/00
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

本發明公開了一種特異性抑制COL12A1基因表達的siRNA及其重組載體和它在逆轉卵巢癌紫杉醇耐藥中應用，屬于分子生物學與生物醫藥技術領域。所述siRNA，包括正義鏈和反義鏈，正義鏈：5’?UCAACUUCUGCCUCAAUGGAA?3’；反義鏈：5’?CCAUUGAGGCAGAAGUUGACC?3’。本發明提供的siRNA可以特異性、高效地抑制COL12A1基因的mRNA和蛋白表達，減少中腫瘤細胞增殖，增加細胞凋亡，降低腫瘤細胞遷移和侵襲能力，并能有效逆轉卵巢癌細胞對紫杉醇的耐藥。本發明還提供了所述siRNA及其重組載體在制備治療卵巢癌、結直腸癌、乳腺癌或逆轉卵巢癌耐藥的藥物中的應用。

技術領域

本發明涉及分子生物學與生物醫藥技術領域，具體涉及一種特異性抑制COL12A1基因表達的siRNA及其重組載體和應用。

背景技術

RNA干擾(RNA interference,RNAi)是動植物中廣泛存在的序列特異性轉錄后基因沉默機制。1998年美國科學家Andrew Fire在秀麗新小桿線蟲C.Elegans體內首次發現將正義鏈和反義鏈的混合物(即dsRNA)所產生的基因沉默效應至少10倍于反義核苷酸的抑制作用，而且能在子代中誘導出同樣的基因抑制現象。對RNAi現象的機理研究表明，微量siRNA即能通過轉錄后基因沉默使大量靶RNA沉默，而這種高效、特異降解同源RNA從而導致序列特異性基因沉默的關鍵性分子是長為21-23堿基的小雙鏈寡核苷酸，也稱作小干擾RNA(siRNA)。進一步研究發現短于21bp或者長于25bp的雙鏈RNA均不能有效啟動RNAi，而且其中只要有一個堿基錯配，基因沉默的效應就明顯減退甚至消失，充分體現了siRNA作用的特異性。

顯示出強大基因沉默效能的siRNA作為近年來生物技術的重大發現而備受矚目，正是因為它具有特異性和高效性阻斷同源基因的基因抑制功能，是基因功能研究強有力的工具。siRNA具有許多傳統方法無法比擬的優勢和特點。目前雖然已有一些抑制特定基因表達的方法，如反義RNA、基因敲除(knockout)等，但siRNA顯示出了明顯優于這些技術的優勢：與反義RNA相比，它具有更高的特異性和持續性；與復雜耗時的基因敲除相比，siRNA是更簡便有效的手段。目前利用siRNA作為基因沉默的方法被廣泛用于惡性腫瘤機制的研究，研究的關鍵點主要集中在如何提高基因沉默效能，包括靶基因位點選擇、導入系統的優化和對宿主細胞功能的影響等，并由此推動了以該技術為基礎的腫瘤特異高效靶向治療策略的研發進程。

卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，其病死率居各類婦科腫瘤的首位。卵巢癌治療最大的障礙是腫瘤細胞耐藥性的產生,特別是出現多藥耐藥。隨著鉑類/泰素藥物聯合化療的實施，卵巢癌的初次化療反應率可達80％。但大多數患者在2～3年內復發。對復發后卵巢癌，即使再采用作用機制完全不同的化療藥物，也產生耐藥，從而使腫瘤治療后生存率得不到顯著的提高。晚期卵巢癌的五年生存率始終徘徊在20～30％。高復發率和復發后的高耐藥率是卵巢癌高死亡率最主要的原因之一，尋找卵巢癌化療耐藥的解決方案是目前腫瘤研究的重要課題。

分子靶向藥物和化療聯合應用是目前提高惡性腫瘤患者生存率最有前景的治療方法。細胞外基質(extracellular matrix,ECM)，是由細胞合成并分泌到胞外分布在細胞表面或細胞之間的大分子，主要是一些多糖、蛋白或蛋白聚糖，這些物質構成復雜的網架結構，支持并連接組織結構、調節組織和細胞的生理活動。ECM能結合生長因子等信號分子，啟動各種信號傳導途徑從而調節細胞形態、遷移運動、增殖、分化等功能。惡性腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移常常伴有ECM表達的變化。COL12A1(Collagen alpha-1(XII)chain)，編碼膠原蛋白12的alpha鏈，染色體定位在6q13-q14.1，它是一個由3000多個氨基酸組成的大分子糖蛋白，是組成細胞外基質的重要成分，對細胞生長微環境的維持有著重要的作用。近年來文獻報道COL12A1在結直腸癌和乳腺癌中有明顯的高表達，是腫瘤細胞發生侵襲轉移的主要分子之一，并且和細胞的分化密切相關。