[發明專利]一種超高效合相色譜測定維生素C的方法

在審

• 申請號: 201710593361.5
• 申請日: 2017-07-20
• 公開（公告）號: CN107367560A
• 公開（公告）日: 2017-11-21
• 發明（設計）人: 董秋月
• 申請（專利權）人: 杭州更藍生物科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及結核分枝桿菌檢測領域，具體涉及一種超高效合相色譜測定維生素C的方法。

背景技術

維生素C又稱L-抗壞血酸，是高等靈長類動物與其他少數生物的必需營養素。抗壞血酸在大多的生物體可借由新陳代謝制造出來，但是人類是最顯著的例外。最廣為人知的是缺乏維生素C會造成壞血病。在生物體內，維生素C是一種抗氧化劑，保護身體免于自由基的威脅，維生素C同時也是一種輔酶。維生素C是維持人身健康的一種不可缺少的物質。它是活細胞氧化還原反應的催化劑，參與體內多種代謝，具有促進體內多種急速合成的生理作用。機體內缺乏維生素C易發生壞血病，嚴重時可造成死亡。醫學研究還發現它不但具有生理活性，而且在人體內能夠阻止亞硝胺的形成，具有一定的防癌作用，增加機體對傳染病的抵抗力，對肝炎、肝硬變有療效旺。同時又是一種理想的食品抗氧化劑。但是人體本身不能合成，必須依靠膳食供給，維生素C廣泛存在于新鮮的水果、蔬菜中。因此建立準確測定維生素C含量的方法有著非常重要的現實意義。

維生素C測定的方法一般有碘量法、比色法、電位法、紫外分光光度法、熒光法等，這些方法選擇性較差，容易受其他還原性成分、丙酮酸和糖等成分的干擾，所需試劑較多、操作繁瑣。近年來高效液相色譜法發展迅速，它具有高效、快速等特點，但是在實驗過程中有機溶劑耗費多，實驗成本較高，并對環境或多或少造成一定的污染。眾多文獻均在傳統的反相液相色譜中對維生素C進行分離分析，由于維生素C本身具有較高極性而導致保留時間較短，嚴重影響到維生素C的準確定量。采用超高效合相色譜法對維生素C進行檢測的方法卻鮮有報道，超高效合相色譜除了具有傳統超高效液相色譜所具有的優點外，還與超臨界流體色譜技術進行結合，以超臨界流體CO₂為流動相主體，依靠流動相的溶劑化能力來進行分離、分析的色譜過程。加之亞2μm填料技術，能夠通過精確地調節流動相強度、壓力和溫度，獲得所需的系統分辨率和選擇性，對待測物的保留和分離進行有效調控，具有操作溫度低，有機溶劑使用量少、靈敏度高、重復性好、分析速度快等優點。超臨界流體是指物質高于其臨界溫度和臨界壓力時的一種物態，它既不是氣體，也不是液體，但它兼有氣體的低黏度、液體的高密度、以及介于氣液體之間的擴散系數的特征。維生素C在紫外波長245nm處有特異性吸收峰，樣品經均質、稀釋、過膜后，檢測食品中的維生素C，可通過保留時間定性，峰面積定量。因此，建立一種超高效合相色譜測定維生素C的方法具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種超高效合相色譜測定維生素C的方法，該測定方法可快速分離并檢測出待測樣品中維生素C的含量，具有高效、檢測速度快、操作簡單、靈敏度高、重復性好、實驗成本低等優點。

為了實現本發明的上述目的，采用以下技術方案：

一種超高效合相色譜測定維生素C的方法，包括以下步驟：

準確稱取5g固體樣品于50mL試管中，加入10g含0.05％H₃PO₄的甲醇-水溶液后，用高壓均質機分兩次均質，置于高速冷凍離心機中離心，取上清液1mL，經微孔濾膜過濾，得到固體待測樣品；

準確稱取5mL液體樣品于50mL試管中，加入含0.05％H₃PO₄的甲醇-水溶液至20mL，置于高速冷凍離心機中離心，取上清液l mL，經微孔濾膜過濾，得到液體待測樣品；

采用超高效合相色譜儀直接分離并測定所述固體待測樣品和所述液體待測樣品中維生素C的含量。

優選的，所述固體樣品為橘子或橙子。

優選的，所述液體樣品為水溶C100。

優選的，所述高壓均質機兩次均質條件為：第一次在14Mpa壓力下均質3min，第二次在9Mpa壓力下均質5min。

優選的，所述高速冷凍離心機離心的轉速為13000r/min，溫度為4℃，時間為10min。

優選的，所述微孔濾膜的孔徑小于或等于0.22μm。

優選的，所述超高效合相色譜儀的分析條件為：色譜柱為Waters Fluoro-Phenyl；流動相為超臨界二氧化碳和等比的含0.05％H₃PO₄的甲醇-水；流速為0.8mL/min；進樣量為1μL；柱溫為30℃；檢測波長為245nm；動態背壓為2000psi，采用梯度洗脫，0-0.2min時8％甲醇，3min時8％-30％甲醇，4min時30％-8％甲醇。

優選的，所述色譜柱的規格為3mm×100mm，1.7μm。