[發明專利]一種人源程序性死亡因子配體PD-L2蛋白的制備方法

有效

• 申請號: 201710592911.1
• 申請日: 2017-07-19
• 公開（公告）號: CN107253988B
• 公開（公告）日: 2021-01-29
• 發明（設計）人: 楊娟娟;夏菁潞;孟春;劉照;羅嶺;俞博彤
• 申請（專利權）人: 福州大學
• 主分類號: C07K14/705
• 分類號: C07K14/705;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發明涉及一種人源程序性死亡因子配體PD?L2（hPD?L2）蛋白的制備方法，屬于重組蛋白的制備方法技術領域。本方法采用PCR技術對整個胞外區進行擴增，并與pET?22b載體進行連接，構建融合表達重組質粒，轉入原核表達系統Rosseta^TM(DE3)宿主菌誘導表達hPD?L2蛋白，獲得上清表達的hPD?L2蛋白，然后利用Ni?NTA柱親和層析純化，獲得高純度、高穩定性、構象均一的蛋白。本發明制備的hPD?L2蛋白可作為抗原免疫Balb/c雌性小鼠，用于制備單克隆抗體。通過本發明制備的hPD?L2蛋白具有流程簡便、周期短、成本低、獲得的蛋白純度高與均一性高的特點。

技術領域

本發明屬于重組蛋白的制備方法技術領域，具體涉及一種人源程序性死亡因子配體hPD-L2蛋白的制備方法。

背景技術

PD-L2作為B7家族的第5個成員，曾被命名為B7-DC或BTDC，是程序性死亡因子1（Programmed Death- 1，PD-1）的主要配體之一。B7家族是僅可以從抗原遞呈細胞APC單向傳遞信號至T細胞的共刺激分子。在T淋巴細胞增殖過程中，PD-L2信號通路充當免疫反應負性反饋調節信號，在免疫調節方面起十分重要的作用。PD-L2與T細胞表面的PD-1受體結合后通過PD-1-PD-L2信號通路調控T細胞增殖及細胞因子分泌，負性調節T細胞活化并促進T細胞凋亡，從而抑制腫瘤細胞的免疫逃逸。該信號通路作為重要的細胞周期檢查點，發揮著特異性的抗原依賴性負性調控作用，是藥物干涉機制以及抗腫瘤免疫治療的靶分子之一，具有潛在的臨床應用價值。hPD-L2蛋白可作為抗原提供抗體結合的表位，該蛋白的制備是后續hPD-L2單克隆抗體制備的前提條件，也為單克隆抗體的制備奠定基礎。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供一種人源程序性死亡因子配體PD-L2蛋白的制備方法。

為此采用如下的技術方案：

一種人源程序性死亡因子配體PD-L2蛋白，氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ IDNO.1-2所示。

所述的蛋白質為如下1)-2)所示的蛋白質：

1) 氨基酸序列和核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1-2所示組成的蛋白質；

2) 將SEQ ID NO.1-2所示的氨基酸序列和/或核苷酸序列進行一個和或幾個

氨基酸/核苷酸序列的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質；

一種人源程序性死亡因子配體PD-L2蛋白的制備方法，采用如下步驟：

1) 以人源程序性死亡因子配體PD-L2的全長編碼基因（序列號為NM 025239.3）為模板，利用PCR技術獲得hPD-L2整個胞外段基因，利用Nde I與Xho I限制性內切酶同時雙酶切PCR產物與載體pET-22b，利用T4 DNA連接酶進行連接，獲得連接產物；

2) 制備DH5α感受態細胞，將連接產物轉化至DH5α感受態細胞，挑取陽性克隆，送至公司進行基因測序，測序成功，獲得pET-22b-hPD-L2重組質粒;

3) 制備Rosseta^TM (DE3)的感受態細胞，將步驟2)獲得的pET-22b-hPD-L2重組質粒轉化至Rosseta^TM (DE3)感受態細胞中，獲得重組菌的單菌落；

4) 挑取單菌落，于10 mL含有50 μg/mL卡那霉素和35 μg/mL氯霉素的LB培養基，在37 ℃條件下過夜培養接種液，接種液按照1：100的體積比接入1 L含有50 μg/mL卡那霉素和35 μg/mL氯霉素的 LB培養基中，培養至OD_{600 nm}值為0.6-0.8之間，然后加入終濃度為0.8 mM的IPTG于22 ℃誘導8 h，收集菌體；