[發(fā)明專利]一種半邊蓮與通泉草的分子鑒別引物及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710592469.2
• 申請日: 2017-07-19
• 公開（公告）號: CN107190090A
• 公開（公告）日: 2017-09-22
• 發(fā)明（設計）人: 陳瑩;魏藝聰;閆淑君;馬志慧;許珊珊
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標代理有限公司35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種半邊蓮與通泉草的分子鑒別引物及方法。

背景技術

半邊蓮(Lobelia chinensis Lour.) 為桔?？贫嗄晟〔荼局参?，全草入藥，是常用中藥之一?！侗静菥V目》載：“生陰濕塍塹邊，就地細梗引蔓，節(jié)節(jié)而生細葉，秋開小花，淡紅紫色，止有半邊，如蓮花狀。”故稱為“半邊蓮”，分布較廣，主產于福建、江蘇、浙江、安徽、江西、廣東與廣西等省。具有清熱解毒，利水消腫等功效，主治毒蛇咬傷，燒傷，扁桃體炎，闌尾炎，癰腫療瘡，肝硬化腹水及多種癌癥等，全草含有生物堿類，黃酮類與多炔類等成分，現代藥理實驗證實具有鎮(zhèn)痛消炎、抗腫瘤、抑制α-葡萄糖苷酶、調節(jié)內皮細胞與抗心肌缺血再灌注等方面作用，已被廣泛應用于各種臨床實踐中，且取得了良好的治療效果。

玄參科植物通泉草（Mazus pumilus）同為矮生草本，生態(tài)位寬度較大，在中國分布廣泛，適應性強，資源較豐富，由于與半邊蓮生長環(huán)境相似，且兩者全草有具有相似的形態(tài)特征等原因，市場上有以通泉草的干燥全草冒充半邊蓮的現象。偽品通泉草與半邊蓮的主治功效不一樣，不能代替半邊蓮藥用，藥材在市場流通時需要準確相互辨別。目前，對半邊蓮的鑒定主要通過性狀鑒別、顯微鑒別與理化鑒別等傳統(tǒng)生藥鑒定方法，而傳統(tǒng)生藥鑒定方法比較依賴個人經驗，不利于推廣。隨著分子生物學的發(fā)展，DNA條形碼(DNA barcoding)鑒別技術因不受被檢測對象形態(tài)特征的影響，通用性強，重復性和穩(wěn)定性高，有統(tǒng)一易于掌握的操作標準和流程，方便于推廣等優(yōu)點，已經成為中藥鑒定有效工具。

長期以來，植物DNA條形碼多選用葉綠體上的DNA序列片段，其中，rbcL在光合作用及光呼吸中起關鍵性作用， 受其功能的限制，rbcL進化速度較慢，主要存在種以上水平的遺傳變異，在物種水平遺傳變異較小，rbcL序列片段全長約1300bp，具有引物通用性強、易擴增、易比對等特點，在PCR分子鑒定中可以提供長度差異較明顯的擴增片段進行辨別，因為物種鑒別方便，實際研究中常選取其作為分子鑒定的DNA條形碼。本研究擬對來源于不同居群的半邊蓮與通泉草的rbcL序列進行聚類分析，并利用其rbcL區(qū)的SNP位點，基于這些位點設計引物，利用該特異引物分別建立特異擴增半邊蓮與通泉草的PCR體系，并在PCR產物中加入SYBR Green I染料對真?zhèn)谓Y果進行快速檢測。結合DNA快速提取技術，可大大提高檢測效率，從而建立2種藥材便捷的鑒定方法。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種半邊蓮與通泉草的分子鑒別引物及方法。

為實現上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

一種半邊蓮與通泉草的分子鑒別引物，所述引物序列為：半邊蓮的鑒別引物LcF：ATGTCACCACAAACAGARACTAAAGC；通泉草的鑒別引物MpF：GCGAAGAAATGATGAAAAGAGGTAT；共同反向引物LmR：CATTTCCCCACGGATGTCCTAA。

一種半邊蓮與通泉草的分子鑒別方法，反應體系為：總體積20μL，其中包括Taq酶1U，10×buffer緩沖液2.0μL，所述的引物各0.2μM，dNTP 20nM，ddH2O補足20μL；PCR反應程序： 95℃預變性4min后，94℃變性30s，55℃退火60s，72℃延伸90s，35個循環(huán)后72℃延伸8min；PCR產物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，以Goldview染色觀察。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

本發(fā)明方法的關鍵在于特異鑒別引物的設計，其難易程度在于可用于鑒別的SNP位點的多寡，應用連續(xù)2-3個SNP位點用于特異鑒別，可提高特異鑒別PCR的穩(wěn)定性與重復性。另外，由于特定樣品中葉綠體DNA比核DNA具有更多的拷貝數，基于核DNA的分子鑒別方法比較容易受到DNA降解的影響，應用來源于葉綠體DNA的條形碼進行分子鑒別更適于干燥的中藥材的分子鑒別。經典PCR檢測方法，需經制膠，凝膠，電泳與成像等多個步驟才能完成檢測，比較繁瑣，本發(fā)明可對樣品的陽性與陰性檢測進行快速識別，大大提高了檢測速度，為本發(fā)明借鑒該方法建立了快速簡便的檢測體系。

附圖說明

圖1 基于NJ 法構建rbcL序列的半邊蓮與通泉草的系統(tǒng)聚類樹。

圖2 半邊蓮與通泉草鑒別方法示意圖。

圖3 特異性PCR鑒別半邊蓮與通泉草凝膠電泳與熒光檢測圖（電泳圖上方為熒光檢測圖），(M:DL2000 DNA maker;1-9:來源不同產地的半邊蓮樣品，10-16：不同產地的通泉草樣品)。