[發明專利]一種男性血源性自體精原干細胞的制備方法和試劑盒及應用

有效

• 申請號: 201710589900.8
• 申請日: 2017-07-19
• 公開（公告）號: CN107287154B
• 公開（公告）日: 2020-06-30
• 發明（設計）人: 林雄斌;湯世坤;任海英;廖喚昭;徐勝美;黃衛紅;吳銘
• 申請（專利權）人: 深圳百年干細胞技術研究院有限公司
• 主分類號: C12N5/076
• 分類號: C12N5/076
• 代理公司: 佛山市廣盈專利商標事務所(普通合伙) 44339
• 代理人: 楊樂兵

1.一種男性血源性自體精原干細胞的制備方法，其特征在于：所述的制備方法包括以下步驟：

(1)將自體來源的細胞作為原料細胞以1×10⁶～5×10⁶的密度接種于細胞培養皿中；

(2)在37℃和5％的CO₂的環境中，將原料細胞在細胞培養液S1中培養3天，得到細胞1；所述的細胞培養液S1為含有以下成分的RPMI 1640培養液：

2～10％的Knockout血清替代品、1～1000ng/mL的促紅細胞生成素、1～1000ng/mL的巨噬細胞集落刺激因子、1～1000ng/mL的粒細胞集落刺激因子、1～1000ng/mL的白細胞介素-3、1～1000ng/mL的白細胞介素-6、1～1000ng/mL的干細胞因子、1～1000ng/mL的堿性成纖維細胞生長因子、1～1000ng/mL的Nanog蛋白、1～1000ng/mL的Oct4蛋白、1～1000ng/mL的Sox2蛋白和1～1000ng/mL的C-myc蛋白；

(3)在37℃和5％的CO₂的環境中，將步驟(2)得到的細胞1再于細胞培養液S2中培養3～6天，得到細胞2；所述的細胞培養液S2為含有以下成分的M2培養液：

2～10％的Knockout血清替代品、1～1000ng/mL的Nanog蛋白、1～1000ng/mL的Oct4蛋白、1～1000ng/mL的Sox2蛋白、1～1000ng/mL的C-myc蛋白、1～1000ng/mL的生殖細胞特異性蛋白DDX4/MVH、1～1000ng/mL的Dazl蛋白、1～1000ng/mL的堿性成纖維細胞生長因子、1～1000ng/mL的表皮細胞生長因子、1～1000ng/mL的白細胞介素-6、1～1000ng/mL Sox17蛋白、1～1000ng/mL的VASA蛋白、1～1000ng/mL的干細胞因子和1～1000ng/mL的粒細胞集落刺激因子；

(4)在37℃和5％的CO₂的環境中，將步驟(3)得到的細胞2再于細胞培養液S3中培養3～6天，得到細胞3，所述的細胞培養液S3為含有以下成分的M16培養液：

2～10％的Knockout血清替代品、1～1000μM的煙酸、1～1000ng/mL的DMC1蛋白、1～1000ng/mL的PRDM1蛋白、1～1000ng/mL的磷酸甘油酸酯激酶2、1～1000ng/mL的睪酮、1～1000ng/mL的卵泡刺激素、1～1000ng/mL的生殖細胞特異性蛋白DDX4/MVH、1～1000ng/mL的Dazl蛋白、1～1000ng/mL的Oct4蛋白、1～1000ng/mLSox17蛋白、1～1000ng/mL的VASA蛋白、1～1000ng/mL的堿性成纖維細胞生長因子、1～1000ng/mL的成纖維細胞生長因子2、1～1000ng/mL的成纖維細胞生長因子7、1～1000ng/mL的骨形態發生蛋白2、1～1000ng/mL的骨形態發生蛋白4、1～1000ng/mL的白細胞介素-6、1～1000ng/mL的神經營養因子4、1～1000ng/mL的膠質細胞源性神經營養因子、1～1000ng/mL的活化素A、1～1000ng/mL的泛酸、1～1000ng/mL的17α，20β-雙羥孕酮、1～1000ng/mL的AY9944-A-7、1～1000ng/mL的表皮細胞生長因子、1～1000ng/mL的血管內皮生長因子、1～1000ng/mL的干細胞因子、1～1000ng/mL的胰島素樣生長因子I、1～1000ng/mL的胰島素樣生長因子II、1～1000ng/mL的生長激素釋放因子、1～1000ng/mL的Ifitm3蛋白、1～1000ng/mL的生長激素、1～1000ng/mL的地塞米松和1～1000ng/mL的粒細胞集落刺激因子；

(5)輕輕吹打依次在細胞培養液S1、細胞培養液S2及細胞培養液S3中培養后得到的細胞3，使細胞3完全懸浮后，收集細胞3于離心管中，進行離心操作，然后使用生理鹽水對懸浮的細胞3進行清洗操作，重復清洗操作3次后，將細胞3懸浮于生理鹽水中，即得到男性血源性自體精原干細胞。

2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述的自體來源的細胞為男性的臍帶血細胞、胎盤細胞、皮膚細胞、血液有核細胞、或脂肪細胞。