[發明專利]一種用于特異性識別DNA序列的納米探針及其應用方法

在審

• 申請號: 201710589829.3
• 申請日: 2017-07-19
• 公開（公告）號: CN107245524A
• 公開（公告）日: 2017-10-13
• 發明（設計）人: 汪聯輝;樊春海;邢益康;晁潔
• 申請（專利權）人: 南京郵電大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 南京知識律師事務所32207
• 代理人: 陳思

技術領域

本發明屬于檢測分析及分子生物學技術領域，具體涉及三角形和十字形的DNA折紙結構作為探針對相同序列的目標基因的特異性標記，實現對環形和線形DNA的高分辨基因序列的定位。

背景技術

基因定位(Genemapping)是基因組測序、醫療診斷和病原菌鑒定等領域中的重要手段，包括在染色體上定位基因片段以及測定基因在染色體上線性排列的順序和距離這兩個方面。根據形態性狀不同進行標記和利用同工酶標記是兩種主要的傳統基因定位方式，基于基因表達的結果來間接反映標記效果。近幾十年中，現代分子生物學技術蓬勃發展，一種新興的遺傳標記技術正日漸成熟，那就是DNA分子標記(DNA mapping)。DNA分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳變異的直接反映。和形態標記及同工酶標記相比，分子標記具有無可比擬的優越性：①它們對表型無影響；②大多數的分子標記是共顯性的，對隱性性狀的選擇十分便利；③由于基因組DNA的變異極其豐富，分子標記的數量幾乎是無限的。分子標記的所有這些特征，奠定了它具有廣泛的應用性基礎。

在DNA納米技術領域，為實現DNA分子標記，奠基人Seeman教授曾利用DNA折紙實現單核苷酸多態性可視化。DNA折紙首先由著名科學家Rothemund提出，他利用一條M13mp18噬菌體環狀單鏈DNA為骨架鏈(scaffold)，設計合成216條訂書釘鏈與骨架鏈堿基互補配對，從而有效地折疊成二維結構，即DNA折紙。DNA折紙具有很好的位點可尋址性且位點間的“分辨率”可以達到4-6nm。利用熒光分子實現DNA分子標記是基于DNA納米技術的另一種應用技術。利用核酸內切酶作用于單分子DNA，再通過DNA聚合酶發揮作用并攜帶熒光分子標記在特定位點，并在全內置反射熒光顯微鏡下觀察?；跓晒夥肿訕擞浀腄NA分子標記方法，與DNA折紙探針的特異性標記相比，其分辨率受限于光學衍射極限的限制。而DNA折紙探針具有構象的多樣性和修飾位點的可尋址性，在原子力顯微鏡可實現高分辨率的直接可視化觀察。

本發明基于DNA折紙技術，獲得了一種新型的納米探針，該探針可用于特異性識別DNA序列。

發明內容

為克服現有技術的上述不足，本發明提供一種新型的用于特異性識別DNA序列的納米探針及其應用方法，可以實現單分子DNA上具有相同序列的基因的定位。

本發明提供一種用于特異性識別DNA序列的納米探針，所述探針為DNA折紙探針，具有三角形或十字形結構。

所述DNA折紙探針按照Rothemund和Seeman的方法制備，并使用100kDa超濾管離心除去多余的訂書釘鏈或瓊脂糖電泳純化并利用Freeze’N Squeeze DNA凝膠抽提離心柱(Freeze’N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns)濃縮回收。

本發明還提供上述用于特異性識別DNA序列的納米探針的應用方法，所述方法包括以下步驟：

步驟一：制備DNA折紙探針；按照Rothemund和Seeman的方法制備折紙，并使用100kDa超濾管離心除去多余的訂書釘鏈或瓊脂糖電泳純化并利用Freeze’N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns濃縮回收；

步驟二：構建基于閉合環狀單鏈DNA的PhiX 174模型或線性雙鏈DNA的Lambda模型；構建模型時采用由三部分組成的“雙嵌段”DNA引物，一部分與目標DNA特定位點結合并有效地延伸，另一部分與DNA折紙探針雜交，中間通過一小段Spacer鏈將這兩部分連接起來；且在延伸單鏈形成雙鏈的過程利用Vent(exo^-)DNA聚合酶。

步驟三：折紙探針的特異性標記；將過量DNA折紙探針與標記有特定雙嵌段引物的目標DNA分子混合反應12小時以上；

步驟四：原子力顯微鏡下成像觀察。

步驟一中，所述不同構象的DNA折紙探針，基于折紙結構的可塑性和可尋址性，可以選擇任意形狀、任意修飾的DNA折紙探針，進行目標基因的多色標記。

所述步驟二中，設置引物部分和捕獲鏈部分的序列長度，形成多個組合的雙嵌段引物，并用于延伸PhiX 174閉合環狀單鏈DNA，探索該雙嵌段引物的延伸效果。