[發(fā)明專利]SPKP?XIII在制備Kv4.1通道抑制劑的應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710589145.3
• 申請日: 2017-07-19
• 公開（公告）號: CN107176989A
• 公開（公告）日: 2017-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 不公告發(fā)明人
• 申請（專利權(quán)）人: 長沙沁才生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種活性多肽在離子通道工具試劑中的用途，尤其是用化學(xué)法制備的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-XIII（簡寫為SPKP-XIII）在制備電壓門控鉀通道工具試劑-Kv4.1型鉀通道抑制劑中的用途。

背景技術(shù)

電壓門控鉀通道廣泛分布于神經(jīng)元、心肌、血管平滑肌、胰腺、骨骼肌等可興奮性組織中，是一種重要的跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，其參與調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的分泌、血管收縮、胰腺分泌和骨骼肌興奮性等多種生理過程,同時(shí)也是治療藥物作用的重要靶標(biāo)之一。鉀通道在動(dòng)作電位的產(chǎn)生和傳播過程中的關(guān)鍵性作用，電壓門控鉀通道成為很多動(dòng)植物毒素的作用靶標(biāo)。鉀離子通道的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究已經(jīng)成為國際上的研究熱點(diǎn)。電壓門控鉀通道很可能成為神經(jīng)性和心血管等疾病的重要治療靶點(diǎn)。自然界的動(dòng)物毒素是一類具有很高實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景的工具試劑或藥物導(dǎo)向物質(zhì)，不僅是有毒動(dòng)物抵御天敵的有力武器，也是從事神經(jīng)生物學(xué)和生理學(xué)研究、天然創(chuàng)新藥物開發(fā)以及蛋白質(zhì)基礎(chǔ)研究的寶貴材料,同時(shí)也是研究離子通道的獨(dú)特“分子探針和解密器”。迄今為止，從多種動(dòng)物（如蝎、蜘蛛、蛇以及海洋動(dòng)物等）的毒液中鑒定到了很多作用于鉀通道的活性成分。它們通過與鉀通道的不同位置相結(jié)合從而引起通道的動(dòng)力學(xué)特征發(fā)生相應(yīng)的變化，如通道去失活、阻塞通道口、易化激活、失活延緩等。通過闡述這些特異性調(diào)制劑作用于鉀通道的分子機(jī)制，除了在理論上可深入推測鉀通道亞型之間的功能活動(dòng)區(qū)別和門控活動(dòng)機(jī)制外，還可以為將它們開發(fā)成治療人類相關(guān)疾病的新藥提供充分的理論基礎(chǔ)和廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在于提供一種廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-XIII在制備電壓門控鉀通道工具試劑-Kv4.1型鉀通道抑制劑的應(yīng)用，所述的廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-XIII（簡寫為SPKP-XIII），其氨基酸序列為：

NH₂-Glu Cys Arg Trp Leu Phe Gly Gly Cys Glu Lys Asp Ala Ser Asp Cys Cys Glu His Leu Gly Cys Arg Arg Ala Lys Pro Ser Trp Cys Gly Trp Asp Phe Thr Phe-NH₂,

其特征在于廣西纓毛蛛毒素提取物-蜘蛛抑鉀肽-XIII作為單一有效活性組份用于制備Kv4.1型鉀通道抑制劑。

所述的蜘蛛抑鉀肽-XIII的N端第2位半胱氨酸和第17位半胱氨酸之間，N端第9位半胱氨酸和第22位半胱氨酸之間，N端第16位半胱氨酸和第30位半胱氨酸之間分別形成二硫鍵。

該蜘蛛抑鉀肽-XIII作為單一有效活性組分用于制備Kv4.1型鉀通道抑制劑，以細(xì)胞外給藥的方式制備成Kv4.1型鉀通道工具試劑。

蜘蛛抑鉀肽-XIII在制備Kv4.1型鉀通道工具試劑或抑制劑時(shí)，配制細(xì)胞外給藥的劑量為5 μmol/L。

蜘蛛抑鉀肽-XIII抑制Kv4.1型鉀通道的作用呈現(xiàn)濃度依從性。

蜘蛛抑鉀肽-XIII對Kv4.1型鉀通道的抑制呈現(xiàn)時(shí)間依從性，是一種較好的Kv4.1型鉀通道工具試劑。

附圖說明

圖1是SPKP-XIII對Kv4.1鉀通道亞型的影響.

圖2是SPKP-XIII作用于 Kv4.1型鉀通道的濃度-效應(yīng)關(guān)系曲線。

圖3是SPKP-XIII作用于 Kv4.1型鉀通道的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系曲線。

具體實(shí)施方式

為了更好的理解和更充分公開本發(fā)明，下面將通過細(xì)胞外給藥途徑，采用非洲爪蟾卵母細(xì)胞模型來說明蜘蛛抑鉀肽-XIII的Kv4.1型鉀通道抑制作用。

1、實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1通道質(zhì)粒的擴(kuò)增和提取

采用promega公司的質(zhì)粒提取試劑盒（Wizard? Plus SV Minipreps DNA Purification System）。

溶液的配方如下：

細(xì)胞重懸液細(xì)胞裂解液

Tris-HCl (pH 7.5) 50mMNaOH 0.2M

EDTA10mM1% SDS

RNase A 100μg/ml

中和液洗脫液

鹽酸胍4.09M 乙酸鉀 60mM

乙酸鉀0.759MTris-HCl (pH 7.5) 8.3mM

冰醋酸2.12M EDTA 0.04mM

pH為4.2 加入95% 乙醇 ,終濃度為60%乙醇

操作步驟：