[發明專利]一種用于豬瘟疫苗效力檢驗的熒光定量PCR方法

在審

• 申請號: 201710588797.5
• 申請日: 2017-07-19
• 公開（公告）號: CN108950059A
• 公開（公告）日: 2018-12-07
• 發明（設計）人: 許秀梅;朱曉瑋;王艷
• 申請（專利權）人: 南京天邦生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70
• 代理公司: 常州佰業騰飛專利代理事務所(普通合伙) 32231
• 代理人: 高姍

1.一種用于豬瘟疫苗效力檢驗的熒光定量PCR方法，其特征在于，

上游引物5'GCTAGAAACAGGCCAACAAC 3'

下游引物5'GAGTAAACTGCCGCACTCAT 3'產物144bp

探針5'CCGCACTCATGATCCCCAT 3'，5’標記FAM,3’標記MGB

包括如下步驟：

步驟1：病毒核酸的提取

分別取PPV、PRV、PRRSV、BVDV、CSFV200μL，按生物病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒的說明方法提取總DNA/RNA；

步驟2：c DNA的合成

反轉錄采用10μL體系，反應管中依次加入5×Buffer、M-MLV反轉錄酶、RNasin、10mMdNTP、10μM下游引物和病毒RNA至10μL，反應后得到cDNA模板，保存備用；

步驟3：標準品制備

在25μL體系中進行目的DNA片段的PCR擴增，經目的DNA片段回收純化、連接、轉化及重組質粒提取，制備標準品；

步驟4：熒光定量PCR特異性試驗

熒光定量PCR使用TAKARA TP800熒光定量PCR儀進行，反應體系為：Premix Ex Taq，上、下游引物，探針，模板和DDH₂O；經預變性，進行40個循環，采集熒光信號，進行TaqMan real-time RT-PCR擴增。

2.根據權利要求1所述的一種用于豬瘟疫苗效力檢驗的熒光定量PCR方法，其特征在于，所述步驟2中，反應管中依次加入：

2μL的5×Buffer；

0.5μL的M-MLV反轉錄酶；

0.25μL的RNasin；

1μL的10mM dNTP；

0.5μL的10μM下游引物；

再加入病毒RNA至10μL；

在42℃溫度條件下，反應1h，或95℃溫度條件下，反應10min，得到cDNA模板，放4℃溫度條件下保存備用。

3.根據權利要求1所述的一種用于豬瘟疫苗效力檢驗的熒光定量PCR方法，其特征在于，所述步驟3包括如下步驟：

步驟31：目的DNA片段的PCR擴增

PCR擴增在25μL體系中進行，反應體系中加入：PremixEx Taq；上、下游引物；cDNA產物；DDH₂O；進行變性；

步驟32：目的DNA片段回收純化

制作大孔瓊脂糖凝膠，對目的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳；在紫外燈下迅速切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠塊放置在離心管中，用Axygen凝膠回收試劑盒回收目的條帶，最后加30μLElution buffer洗脫DNA，保存于-20℃條件下備用；

步驟33：目的DNA片段的連接與轉化

將大孔瓊脂糖凝膠回收純化后的PCR產物，采用pMD18-T載體DNA連接試劑盒，反應體系中加入試劑，試劑加完后瞬時離心，混勻，連接過夜，將連接產物加入感受態細胞DH5a中，混勻后，加入LB液體培養基培養，將培養物離心，過濾上清，再將沉淀混勻涂布于LB瓊脂平板上培養；

步驟34：含目的DNA片段的重組質粒提取

挑取經PCR鑒定為陽性的菌落，接種到含有Amp的LB液體培養基中，搖動培養過夜，用Axygen制備質粒試劑盒提取質粒，加入含有RNase的TE緩沖液中，水浴，在紫外分光光度計OD₂₆₀測定質粒的質量濃度，作為定量PCR的標準品，保存，備用。

4.根據權利要求3所述的一種用于豬瘟疫苗效力檢驗的熒光定量PCR方法，其特征在于，所述步驟31中，反應體系中加入：PremixEx Taq 12.5μL；上、下游引物各0.5μL；cDNA產物1μL；加DDH₂O至25μL；反應在95℃條件下變性5min；變性參數如下：在94℃條件下變性40s；在55℃條件下退火30s；在72℃條件下延伸30s；連續進行34個循環，循環結束后，在72℃條件下延伸5min。