[發(fā)明專利]一種鯽魚冠狀病毒HB93及RT?PCR檢測引物及應用

有效

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• 申請日: 2017-07-19
• 公開（公告）號: CN107201345B
• 公開（公告）日: 2018-01-09
• 發(fā)明（設計）人: 陳孝宇;梁昊;郭少飛;陳鑫
• 申請（專利權）人: 湖北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N15/11;C12N15/50;C12Q1/70;C12Q1/68;A61K39/215;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所42001
• 代理人: 龔瑩瑩

技術領域

本發(fā)明屬于病毒分子檢測技術領域，具體涉及一種鯽魚冠狀病毒HB93及RT-PCR檢測引物及應用。

技術背景

國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)于2012年發(fā)表了最新的病毒分類第九次報告，將套式病毒目(Nidovirales)中的冠狀病毒科(Coronavi ridea)中新設冠狀病毒亞科(Coronavirinea)和環(huán)曲病毒亞科(Torovirinae)。

冠狀病毒科是一類線形單股正鏈RNA病毒，最早于1937年從雞身上分離出來，Alme ida等對這些病毒進行了形態(tài)學研究，電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)這些病毒的包膜上有形似日冕的棘突，故提出命名這類病毒為冠狀病毒^[1]。1975年，國際病毒命名和分類委員會正式命名了冠狀病毒科。2002-2003年期間，自我國局部地區(qū)發(fā)生的非典型肺炎，即由冠狀病毒屬的嚴重急性呼吸綜合征病毒(SARS-CoV)引起，世界上有30多個國家和地區(qū)相繼報道出現(xiàn)病例，病死率超過10％。2012年，中東地區(qū)開始出現(xiàn)新型冠狀病毒，病死率超過50％，引起了世界范圍的廣泛關注，造成社會對冠狀病毒的恐慌。因此，對冠狀病毒進行深入研究具有重要意義。

目前對冠狀病毒科的研究主要集中在冠狀病毒亞科，而對環(huán)曲病毒亞科研究甚少。其中，2006年鳊魚病毒屬(Bafinivirus)的中的鳊魚病毒(White bream virus)由Schütze H等科學家在鳊魚體內發(fā)現(xiàn)，這也是目前ICTV分類中確定的唯一以水生動物為宿主的冠狀病毒。

目前鯽魚冠狀病毒(Crucian Carp Bafinivirus,CCBV)尚無公開報道，更也無有效的檢測方法。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供了一種鯽魚冠狀病毒HB93，所述的病毒分離自鯽魚病變細胞，該病毒已于2017年5月11日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心進行保藏，分類命名：鯽魚冠狀病毒(Crucian Carp Bafinivirus)HB93，保藏編號：CCTCC NO：V201722，地址：中國武漢武漢大學。

本發(fā)明的另一個目的在于提供了基于鯽魚冠狀病毒HB93的全序列(SEQ ID NO.1所示)與其他病毒的全序列的差異設計的引物，利用該引物可用于檢測鯽魚冠狀病毒HB93。

本發(fā)明的還有一個目的在于提供一種鯽魚冠狀病毒HB93RT-PCR檢測引物，所述的引物為F1：5'-CAAAGTAAACCCTGGAGA-3'，R1：5'-ATCAATGATGGTGCAGTT-3'；F2：5'-TGAAACAATCCAAGAAGA-3'，R2：5'-ACAAGTTATAGCCGGTGT-3'。

本發(fā)明還有一個目的在于提供了鯽魚冠狀病毒HB93的應用，所述的應用包括利用該病毒制備成鯽魚冠狀病毒病疫苗，或是制備成鯽魚冠狀病毒的實驗室對照品。

本發(fā)明的最后一個目的在于提供一種鯽魚冠狀病毒HB93RT-PCR檢測引物的應用，包括利用所述的應用制備成鯽魚冠狀病毒檢測試劑盒。

為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術措施：

一種鯽魚冠狀病毒HB93，所述的病毒分離自鯽魚病變細胞，該病毒已于2017年5月11日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心進行保藏，分類命名：鯽魚冠狀病毒(Crucian Carp Bafi nivirus)HB93，保藏編號：CCTCC NO：V201722，地址：中國武漢武漢大學。

將鯽魚冠狀病毒HB93(本發(fā)明或稱為CCBV-HB93)接種到草魚性腺細胞(Grass car p ovary cell line,GCO)單層，25℃培養(yǎng)7天，產(chǎn)生細胞病變效應(CPE)，可見GCO細胞收縮變圓、折光度增加，部分細胞開始脫落，細胞單層開始破裂。

培養(yǎng)基：M199，10％胎牛血清，pH 7.0～7.2。

鯽魚冠狀病毒HB93的形態(tài)特征：病毒呈棒狀，四周有明顯的日冕狀棘突結構，與典型的冠狀病毒形態(tài)相符。

鯽魚冠狀病毒HB93的應用，所述的應用包括利用該病毒制備成鯽魚冠狀病毒病疫苗，或是制備成鯽魚冠狀病毒的實驗室對照品。

本發(fā)明的保護內容還包括基于鯽魚冠狀病毒HB93的全序列(SEQ ID NO.1所示)與其他病毒的全序列的差異設計的引物，所述的引物包括基于該差異序列，利用現(xiàn)有技術設計的諸如熒光定量引物，LAMP引物，數(shù)字PCR引物等，利用該引物可用于檢測鯽魚冠狀病毒HB93。