[發明專利]Suc-Ile-Glu(γ-Pip)-Gly-Arg-pNA·HCl的制備方法

有效

• 申請號: 201710586859.9
• 申請日: 2017-07-18
• 公開（公告）號: CN107474108B
• 公開（公告）日: 2021-09-03
• 發明（設計）人: 謝永華
• 申請（專利權）人: 上海太陽生物技術有限公司
• 主分類號: C07K5/103
• 分類號: C07K5/103;C07K1/06
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

本發明屬于多肽合成領域，具體涉及Suc?Ile?Glu(γ?Pip)?Gly?Arg?pNA·HCl的制備方法。該方法采用雙烯丙氧羰基(bis?Alloc)對精氨酸的胍基進行保護，從而使其不受酸堿的影響；先將對苯二胺連接在氨基酸上，然后再以過氧化氫和三氟乙酸酐對其氧化，從而提高了對硝基苯胺與氨基酸縮合的收率、安全性和環保性。對各氨基酸采用適宜的保護基，從而提高了反應過程的穩定性。本發明提供的方法具有工藝環保、安全、收率高、制備成本相對較低等優點，適合于大批量制備。

技術領域

本發明屬于多肽合成領域，具體涉及Suc-Ile-Glu(γ-Pip)-Gly-Arg-pNA·HCl的制備方法。

背景技術

Suc-Ile-Glu(γ-piperidyl)-Gly-Arg-pNA·HCl是一種人工合成可以被活化X因子(factor Xa)催化水解的多肽化合物，其簡稱為S-2732，常作為發色底物。該底物可用于凝血因子Xa和肝素抗Xa活性的定量檢測，因此其在科研和臨床上都有著廣泛的用途。

現有文獻未發現有關S-2732合成的報道，查閱其他相關的合成文獻，可以發現將發色基團對硝基苯胺連接到氨基酸上是S-2732合成的關鍵點之一。這是因為對硝基苯胺上的硝基具有強吸電子作用，導致對硝基苯胺的親核性非常差，通過一般的酰胺縮合方法，其產物收率往往很低。為了解決這一難題，有研究采用三氯氧磷作為縮合劑，將對硝基苯胺高效率地連接到氨基酸上。但是這種方法有著自身的缺陷：一是對硝基苯胺的毒性很大，在使用過程中對人體或者環境具有重大安全隱患；二是所用的縮合劑三氯氧磷的毒性也很大，這顯然對大批量生產產生不利的影響。

精氨酸的胍基具有強親核性和堿性，在多肽合成中須加以保護。從現在文獻中可以找到的許多胍基保護基團：叔丁氧羰基、硝基、甲苯磺酰基、三氟乙酰基、芐氧甲酰基保護以及固相合成中使用較多的苯磺酰基類等。精氨酸具有多個活性基團，因此需要多個保護基團。但上面提到的保護基團都具有在酸性或者堿性條件下脫除的性質，這顯然是不利于多肽合成。

發明內容

有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供發色底物S-2732的制備方法，本發明提供的方法收率高，純度大。

本發明提供的Suc-Ile-Glu(γ-Pip)-Gly-Arg-pNA·HCl的制備方法包括：

過氧化氫、三氟乙酸酐與Fmoc-Arg(Alloc)₂-pPDA反應，制得Fmoc-Arg(Alloc)₂-pNA；

Fmoc-Arg(Alloc)₂-pNA依次與Gly、Ile-Glu(γ-pip)和琥珀酸酐縮合后，經脫保護、成鹽制得Suc-Ile-Glu(γ-Pip)-Gly-Arg-pNA·HCl。

本發明實施例中，所述過氧化氫和三氟乙酸酐與Fmoc-Arg(Alloc)₂-pPDA的摩爾比為(5～6)：(6～7)：(1～1.5)。

本發明實施例中，所述反應的溶劑為二氯甲烷，所述過氧化氫為質量分數為90％的過氧化氫水溶液；所述反應具體包括：過氧化氫與三氟乙酸酐在冰浴的二氯甲烷中混合，室溫攪拌30min后，滴加Fmoc-Arg(Alloc)₂-pPDA的二氯甲烷溶液，加熱回流1h。

由于硝基的強吸電子作用，親核性非常差，一般的酰胺鍵合成方法很難縮合成功。同時對硝基苯胺屬于高毒性物質，不利于生產和制備。本發明先將對苯二胺連接在氨基酸上，然后再對其氧化，從而將發色基團對硝基苯胺連接到精氨酸上，這種縮合方式比較環保、安全，收率在80％以上。

本發明實施例中，所述Fmoc-Arg(Alloc)₂-pPDA的制備方法為將Fmoc-Arg(Alloc)₂-OH以HOBt、DIEA和EDCI活化后，與對苯二胺室溫反應8～12h。