[發(fā)明專利]一種快速分析甲殼動物血淋巴細胞類群和數(shù)量的方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710583739.3
• 申請日: 2017-07-18
• 公開（公告）號: CN107490672B
• 公開（公告）日: 2019-12-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張亦陳;胡錦麗;劉逸塵;晉偉;耿緒云;孫金生
• 申請（專利權(quán)）人: 天津師范大學
• 主分類號: G01N33/483
• 分類號: G01N33/483;G01N21/84
• 代理公司: 12207 天津市杰盈專利代理有限公司
• 代理人: 朱紅星<國際申請>=<國際公布>=<進入

本發(fā)明公開了一種用于快速檢測多種常見甲殼動物血淋巴細胞種類和數(shù)量的方法。其原理為凡納濱對蝦、克氏原螯蝦以及中華絨螯蟹等甲殼動物血淋巴細胞內(nèi)的顆粒結(jié)構(gòu)可以作為分類參考，利用具有圖像輔助功能的多維全景分析儀，以樣點所在分區(qū)和輔助圖像為依據(jù)，可甄別不同類群血淋巴細胞并自動完成統(tǒng)計分析。本方法的特點為:不用染色，避免常規(guī)染色及顯微鏡觀察等述諸多人工環(huán)節(jié)的影響；利用高靈敏度檢測器的自動化信號分析，重復性好；多維全景檢測儀具有高通量檢測能力，數(shù)萬細胞樣點的結(jié)果可靠性也遠超過人工計數(shù)；微量檢測所用試劑耗材很少，成本低。本方法不但可用于科學分析、日常監(jiān)測，還可為分類收集血淋巴細胞提供技術(shù)支持，有巨大應(yīng)用價值。

本專利申請由天津師范大學生命科學學院/天津市動植物抗性重點實驗室完成，得到國家自然科學基金（31472299），天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃（15JCZDJC33800），天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室開放基金(TJAE2015005) ，“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題（2011BAD13B04）的資助。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于檢測技術(shù)領(lǐng)域，以胞內(nèi)顆粒特征為基礎(chǔ)，結(jié)合多維全景檢測儀的圖像輔助分析功能對凡納濱對蝦、克氏原螯蝦及中華絨螯蟹等常見甲殼動物的血淋巴細胞進行準確分類和比例分析，建立一種適用于依據(jù)胞內(nèi)顆粒差異進行分類的高效血象檢測方法。

背景技術(shù)

甲殼動物血淋巴的功能與脊椎動物的血液類似，其中的各類細胞承擔著重要的免疫職責，因此對各類血淋巴細胞進行準確分類、統(tǒng)計是開展科學研究及客觀評價健康狀況的重要支撐。人類等高等動物的血細胞研究技術(shù)十分成熟，通過各種單克隆抗體不但能夠?qū)γ款惣毎M行辨識區(qū)分，還能精確分析細胞所處的不同分化時期以及生理狀態(tài)，因此，各種特異性抗體的生產(chǎn)是血細胞研究的重要保障。反觀甲殼動物，專用抗體的缺乏成了制約血淋巴研究的瓶頸。

單克隆抗體的淘選有賴于足量純化的抗原性物質(zhì)的制備，就甲殼動物血淋巴而言，需要辨識和分離出來足量的各類細胞。從19世紀開始，國內(nèi)外學者就利用光鏡染色、電鏡切片、組織化學等技術(shù)對蝦蟹等甲殼動物的血淋巴進行分類研究。但由于都是基于不同研究者的人工觀察和判定，因此所描述的分類特征和判定依據(jù)不盡相同，迄今對甲殼動物血淋巴細胞的分類尚存在爭議。Cornick等（1978）根據(jù)細胞內(nèi)所含顆粒的大小、與染料的親和性以及折光性，將鰲龍蝦血細胞劃分為前透明細胞、透明細胞、嗜伊紅顆粒細胞和嫌色細胞四類。Hose等（1990）對美洲鰲龍蝦、短溝龍蝦和大彎吻蟹的血細胞形態(tài)進行細胞化學性質(zhì)研究，并結(jié)合電鏡和光鏡結(jié)果，將甲殼類血細胞分為透明細胞、大顆粒細胞和小顆粒細胞。葉燕玲等（1993）和于建平（1993）分別對中國對蝦和日本對蝦血淋巴細胞進行了分類研究，并將其分為透明（或無顆粒）細胞、小顆粒細胞和大顆粒細胞。陳平等（1998）則通過電鏡觀察將中國對蝦、日本對蝦、長毛對蝦和草蝦的血淋巴細胞分為四類：透明細胞、小顆粒細胞、大顆粒細胞和“漿樣細胞”。戰(zhàn)文斌等（2001）收集中國對蝦混合血淋巴細胞免疫小鼠后篩選到三株單克隆抗體，并利用自制單克隆抗體對中國對蝦的血細胞分類進行了初步嘗試，結(jié)果也僅估計透明細胞占比約60%，小顆粒細胞占比約30%，而且未能給出其它種類細胞類型和所占比例的統(tǒng)計。孫敬鋒等（2008）嘗試用流式細胞儀對三種蝦類血細胞進行分類，但只能區(qū)分出三類細胞，而且類群邊界不甚清晰。有鑒于此，冼建安等（2015）不對血淋巴細胞加以分類，而是以流式細胞儀直接測量混合血淋巴細胞總數(shù)，并據(jù)此判斷健康狀況。由此可見，雖然在甲殼動物血淋巴細胞分類方面有很多前期研究，但都因沒有適合的儀器和普遍適用的方法而進展緩慢，所以迫切需要一種新的快速、準確、重復性好的自動化分類統(tǒng)計方法。